【张浩千的回答(8票)】:
关于合成DNA的原理，楼上各位已经介绍很多了。的确，目前在DNA分子的合成层面，最大的技术困难就是如何合成长链的DNA分子。另一个重要的问题是，合成的DNA分子如何进行高效的组装？
传统的限制性内切酶效率低、限制多；新兴的gibson assembly方法依赖于PCR，但只要是PCR，在基因组水平的DNA组装上，就一定会发生突变；不依赖于PCR的golden gate方法目前是最可靠最高效的方法，新近一系列基因组水平DNA合成的文章大都采用了此方法。然而即便如此，也只是一次组装5~8个长度在1k~2k之间的片段，比起基因组水平动辄以百万碱基作为单位的长度，还是小巫见大巫。
通量低必然导致成本高，也就成了合成大片段DNA的最大门槛。
【丁元赫的回答(5票)】:
赞同 @胡盼和 @甘小小的回答，人工合成大片段基因第一步就是合成长核苷酸链的问题，因为核苷酸是一个个加上去的，即使每一步得率都很高，但一旦长了就没有办法。现在我们在invitrogen合成引物（单核苷酸链），单条在56个（好像？）核苷酸以下的一个价，56个以上的另一个价，最长不能超过120个（好像？），这似乎就是目前用固相亚磷酰胺三酯法合成引物的极限了。
因为基因组是双链的，我们可以通过合成互补的两条单链退火得到需要的双链，这样得到的不过是一百来个碱基对的DNA双链。而最小的有细胞结构的生物的基因组也有160kb之巨。
为了得到更长的DNA双链，我们可以用分子生物学的工具来做到。比如，在模板存在的情况下，我们可以通过PCR的方法，使用高保真的聚合酶，一次性扩增产生10kb以上的片段；我们还可以通过限制性内切酶和连接酶的工具，将多个DNA片段连结上；我们也能通过使用quikchange诱变的方法对DNA序列进行小范围的修改；我们还能通过BAC、YAC等载体将得到的超长片段在细菌或酵母内保藏、扩增。如果不考虑基因组的装配，以现在的技术，我们是能够获得长达一万kb的DNA双链的，请看这货的工作：JCVI: First Self-Replicating, Synthetic Bacterial Cell Constructed by J. Craig Venter Institute Researchers。
基因合成无法做到像3D打印的原因是尺度不同，3D打印是在宏观尺度上材料的构筑，而基因合成是在分子尺度上的化学反应，它们的原材料服从的物理规律不一样。除非咱能得心应手地操作单分子。
如果我们硬要从一堆无机物，de novo做一个生命出来，俺不知道还有多远，不过乐观估计是以十年为单位计算的。这个问题可能是没有意义的，因为以现有的生物资源，我们似乎只用在它们的基础上进行修改、不断地修改，就能够满足人类的需求了。而这样的事情，不是有人在做么？此所谓：转基因。
【朱红的回答(15票)】:
现在最常用的DNA合成方法是固相亚磷酰胺三酯法，从3‘到5'合成，
1、脱保护基 (Deblocking)
用三氯乙酸 (Trichloroacetic Acid，TCA) 脱去连结在CPG (Controlled Pore Glass) 上的核苷酸的保护基团DMT (二甲氧基三苯甲基)，获得游离的5'-羟基端，以供下一步缩合反应。
2、活化 (Activation)
将亚磷酰胺保护的核苷酸单体与四氮唑活化剂混合并进入合成柱，形成亚磷酰胺四唑活性中间体 (其3'-端已被活化，但5'-端仍受DMT保护)，此中间体将与GPG上的已脱保护基的核苷酸发生缩合反应。
3、连接 (Coupling)
亚磷酰胺四唑活性中间体遇到CPG上已脱保护基的核苷酸时，将与其5'-羟基发生亲合反应，缩合并脱去四唑，此时合成的寡核苷酸链向前延长一个碱基。
4、封闭 (Capping)
缩合反应后，为了防止连在CPG上的未参与反应的5'-羟基在随后的循环反应中被延伸，常通过乙酰化来封闭此端羟基，一般乙酰化试剂是用乙酸酐和N-甲基咪唑等混合形成的。
5、氧化 (Oxidation)
缩合反应时核苷酸单体是通过亚磷酯键与连在CPG上的寡核苷酸连接，而亚磷酯键不稳定，易被酸、碱水解，此时常用碘的四氢呋喃溶液将亚磷酰转化为磷酸三酯，得到稳定的寡核苷酸。
因此每增加一个碱基需要5步反应，即使假设每一步效率是99%，那么总的效率也是0.99^(5*碱基长度)，用科学计算器很容易算出来100bp的最终目标产品的占总量的比例。
因为DNA合成是在固相上进行的，每一个碱基的合成包含了脱保护基(DMT)、碱基的加成、盖帽(Capping)、氧化等步骤。如果说某一个碱基由于种种原因(如瓶中溶液没有了，或管道堵塞)，未加入到正在延伸的Oligo上，那么下一个反应Capping将会把Oligo封死，使整个oligo合成立即中止。在纯化过程中，这种合成不完全的短片段是可以被去除的，因此化学合成的精确性是没有问题的；
但是Hecker,KH使用两条长123和126的化学合成的DNA，用DNA聚合酶进行primer,extension并且酶切连接转化后检查in vivo的复制发现：
Five of the ten inserts sequenced contained errors, including seven single-base-pair deletions, one four-base-pair deletion and one G-->C transversion. The origins of the latter two errors are unclear, but single-base deletions are inconsistent with errors of polymerases; thus, the most common sequence errors of chemical synthesis are deletion mutations. Deletions are most likely to result from incomplete capping or de-tritylation.
好像不知道为什么合成的DNA复制错误率还是挺高的，这篇太老了下不到我就懒得再找全文了……
现在也全基因合成，乃是把基因组分别设计成很多短片段然后一步步PCR得到的(Hoover, D. M., & Lubkowski, J. 2002)，要合成一个10kb的全基因，想想就真是一件天怒人怨的事情啊……
【艾比斯的回答(33票)】:
谢邀，正如评论所说，每一句问题描述都是一个课题。对于我这种得个目的片段用PCR，合成DNA片段找公司的人来说，我尚未遇到瓶颈哈哈。对于题主的问题也只能翻翻文献给个我认为能解释的答案。
回答这个问题，不明确的地方有：大片段基因有多大，多少bp算大？题主所指的基因概念模糊，是单个基因还是基因组？目前单个基因以及多个基因的合成技术很成熟了，但是大片段的（≥100kbp）DNA合成研究的较少，难度也很大。
目前人工合成基因的方法除了从自然界中获取样品再通过PCR（聚合酶链式反应）扩增外，就是用化学合成的方法合成而不需要模板。化学方法合成主要是固相亚磷酰胺三酯法，原理看下面参考文献，也有其他人提到了，合成的寡核苷酸链越长，得率越来越低，出错率越来越高，因此目前不可能用化学方法愣头愣脑直接合成哇长哇长的DNA片段。
大片段DNA合成的基本策略是：
1、将dNTP(也就是原料)按照要求的DNA序列合成寡核苷酸；
2、将寡核苷酸组成较短的DNA序列（400-600bp）；
3、将短的DNA序列通过融合连接的方法连成长的基因序列（＞1kbp）；
4、通过普通的酶连接法或细胞体内重组合成更长的基因和组成基因组的长片段(≥ 10kb)；
5、在大肠杆菌及酵母中依次组装，最后达到超过1 Mb的基因组；
6、将合成的基因组移植到细胞中去，并使合成的基因组的基因按要求表达。
大片段基因的合成难点在哪？
大致的理由其他人也说了，DNA长，周期长、易出错。
1、合成成本高。合成1Mbp的双链DNA大约需要20w美元。这只是碱基的价钱，还有时间、基因设计分析等等；
2、DNA合成过程易出错，出错概率在1-11个/kbp,那么，每合成一段DNA则需要测序比对，找到突变位点并修复，这个过程复杂又漫长；
我们离人工制造生物还有多远？
世界上有很多课题组有基因合成和人工生命合成尝试。想要得到像人这样复杂的生命体还要很久，目前都是合成原核生物的基因组。以下是个例子：
2010年《Science》杂志发表的文章“Creation of a Bacterial Cell Controlled by a Chemically Synthesized Genome”介绍了 J. Craig Venter课题组人工合成1.08Mbp的基因组导入到 M. capricolum的受体细胞中并创造出新的M. mycoides细胞，可以认为是人工合成的生命结构，该细胞内只含人工合成的DNA序列并且有预期的表型，同时能够连续复制。
下图是该课题组人工合成基因的方法
大致流程是在体外合成110个10kbp的DNA（蓝色片段）并在酵母细胞中装配，这110个DNA片段10个为一组连成11个100kbp的片段（绿色片段），最后将这11个大片段连接成基因组（红色环）。整个基因组包括4个watermarker及若干酶切位点以保证有选择性标记。大致流程是在体外合成110个10kbp的DNA（蓝色片段）并在酵母细胞中装配，这110个DNA片段10个为一组连成11个100kbp的片段（绿色片段），最后将这11个大片段连接成基因组（红色环）。整个基因组包括4个watermarker及若干酶切位点以保证有选择性标记。
其实单纯的合成大片段基因只要有钱有时间有精力，慢慢搞肯定能搞出来，更难的在于基因的排列、非结构基因分析、代谢通路、蛋白组学的研究等等，这些问题没有解决的情况下，人造生物的合成那还差得远。
不知此回答题主满意否 @袁霖
参考：Gibson DG et al. Creation of a bacterial cell controlled by achemically synthesized genome. Science, 2010, 329: 52-56
王冬梅.从碱基到人造生命——基因组的从头合成.生命的化学
【杨静波的回答(2票)】:
问题在于连接效率。片段越长连接效率越低。
【知乎用户的回答(1票)】:
合成越到后面，效率越低。最后得到的产物少得可怜，又有非常多的杂片段，得想办法纯化。
【知乎用户的回答(0票)】:
因为没有这方面的需求。具体的回头补充。
【SongShuang的回答(1票)】:
如果你能完全人工合成一大段完整、自洽的基因序列，也就意味着你可以创造一个生命。基因都是“活着”的。基因不是计算机程序代码，装在硬盘里就可以实现调用、运行、拷贝等等。这也是DNA测序计划完成数十年后，再也没有什么飞跃性进展的原因之一。人类想要工业化利用已知的基因序列知识，目前还很难。这也是为什么网上很多人吐槽生物科学研究周期慢、效率低的原因。
1.模拟活体生物分子活性所需的环境，代价太过昂贵。很多生物分子，包括基因序列，都只是在人体的某个非常苛刻的环境下才发挥那一点点作用，采用理科的思维，将其剥离到人工环境下观察，需要的代价太大。
2.寻找可以被人类利用，来进行简单而精确的逻辑操作的“工具酶”很难（酶是由生物自己产生的，生物进化到现在不可能会允许自己的基因被别人随意当作“工具”）
3.这类研究经济效益很低。人体本身就是一个最好的“生物工厂”，就算你费尽心机去摸透了人体所有基因的表达和运行方式，我们大部分人还是该吃吃，该喝喝。并且，从伦理上、道德上，想要改变生命自身的规律是“禁忌”的。连一个“转基因”食品，各界人物都可以在完全不知内情的情况下随意品评的社会，大刀阔斧地深入研究，很难。
以上三点，可以看出生物研究、基因研究还处在“黑箱实验”阶段。类似于物理学中的“薛定谔之猫”的表述。我们的实验对象、实验途径都是自己不可控制的。我们产出的产品甚至可能不如野花野草熬成的苦水汤有效。对于这些，我们只能“讲道理”。但是道理，永远在消费者一边。
以上。
【JadeShan的回答(2票)】:
因为真的很难“精确合成”
就像你弄出个10节车厢的火车还好，弄出个100000节车厢的火车，有点难度
离人工制造生物距离大概100年吧，当然，人工修改也许六七十年就可以做到
【胡盼的回答(14票)】:
即便是每一步产率都有95%，每一步能精确连接1个核糖，那么1000个核糖的单链DNA总产率就是0.95的1000次方 5.29e-23....
有机狗内流满面，全合成狗倒地不起_(:з」∠)_
【知乎用户的回答(1票)】:
吐槽下知乎不能编辑表格还要我截图。
大肠杆菌复制相关蛋白
我的意思很简单，就算是大肠杆菌这么简单的原核生物，DNA复制都需要这么多酶。我的意思很简单，就算是大肠杆菌这么简单的原核生物，DNA复制都需要这么多酶。
目前基本上合成DNA都是用的化学方法，想要完整不出错的复制完高等生物那几个G的DNA链，难度不下于猴子随意敲键盘，结果打出来一部莎士比亚全集。
【JimWalden的回答(0票)】:
@袁霖 泻药，问题提得非常好，我就曾幻想有一种分子摄影机，它可以像拍电视似得记录细胞内各种分子的动态，那样我们就不必去验证各种分子机理（谁激活谁，谁抑制谁，谁和谁一同发挥作用blabla），不去花大量的时间制样做电镜，我们想知道什么看个video 就好了么。但是我们不能，因为目前工程技术还不能够达到这样随心所欲的水平。利用3D打印技术合成全基因组，从分子层面操纵生命？现阶段同理也不能实现。直接获得大片段基因，只能借助克隆科学网—科学家发现直接克隆大片段DNA方法。而所谓的从头合成大片段基因，是靠一小段一小段的DNA拼接而来，其中的缘由知友已经解释过了，不再详述。我们可以寄希望于工程师，或许他们能设计出3D打印分子技术？！也未可知。
话说回来，即便能够合成基因，也不意味着能够制造生命，这样有点唯基因论了。
细胞的生命是由其物质环境和能量环境所控制的，而不是其基因。基因只不过是用于细胞、组织和器官构造的分子蓝图。而环境却像一个“承包商”，解读、运用那些基因模型，并最终为细胞的生命性状做准备。使生命机制投入运作的，是单个细胞对环境的“认知”，而不是基因。——《信念的力量：新生物学给我们的启示》美 布鲁斯·H·利普顿
我的理解，合成基因是制造生命的一小步。一个很有意思的人——克萊格·凡特已经开始着手研究，参见人造生命。他的团队用合成一段基因，置换一个自然细胞的基因组，得到了Mycoplasma laboratorium，这大概是我们现阶段为人工制造生命做出的努力，但正如克莱格自己所说的“我们并不认为这是‘从零开始创造生命’，更确切地说，我们能用合成的DNA，从已经存在的生命创造新生命。”
总之，实现de novo 合成生命，“任重而道远”。
【罗大吹的回答(0票)】:
关于题主最后一个问题，有兴趣可以研究下一门叫做合成生物学的学科。
【G小强的回答(0票)】:
钱
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