炎症+自噬，两个表型的交叉研究套路

作者：酸菜

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这次是文献精读春季班的最后一讲，来讲讲一篇炎症和免疫的文献。这是2016年eLife上的一篇文章，eLife差不多7-8分的水平。文章能发到ELife上是因为这是篇做转基因动物的文章。

从文章题目看有这么几个关键词：自噬、自噬相关的基因Atg16l1、T细胞亚群、肠道炎症。其中，自噬是2016年诺贝尔生理学医学奖的获奖对象，已经热了好多年了。自噬，顾名思义就是自己吃自己，在自噬过程中细胞从内质网脱落膜去包裹细胞质、蛋白或者细胞器，形成自噬小体，与溶酶体融合形成自噬溶酶体，然后就能降解包含的内容物。

自噬的平衡非常重要，过多和过少都会影响细胞的存活。本文将自噬中的一个基因放到了炎症中去研究，这种做法在基础科研中也是有套路的，下面会具体分析。

背景知识

本文展示了自噬的整个过程，包括启动信号，形成预吞噬的自噬泡，形成自噬体，上图展示了一些自噬的激活信号（蓝色）和抑制信号（橙色）。

再来交代下免疫和炎症，这里主要是肿瘤免疫。研究免疫要区分研究固有免疫还是适应性免疫，适应性免疫就是T细胞免疫等特异性免疫，而固有免疫就是非特异性免疫，两者主要区别在于需不需要特异性的抗原刺激。

如果是研究固有免疫的，研究对象可以是DC细胞、NK细胞、巨噬细胞等等；如果是研究适应性免疫，那就要继续细分是研究细胞免疫还是体液免疫，细胞免疫主要是T细胞介导，而体液免疫是B细胞来进行。这篇文章的内容着重于T细胞免疫。

T细胞有很多细胞亚群，比如左边那些，这篇文章重点在Th2和Treg上面。

一旦谈到免疫和炎症，要怎么和临床上的疾病结合起来呢？有4个相关度比较高的疾病，感染性疾病、自身免疫性疾病、慢性炎症和肿瘤（炎癌转化）。又有哪些因素可以引起免疫反应？目前研究比较多的机制有热休克反应、氧化应激、不正常蛋白折叠、DNA损伤等等。不过本文从另一个角度把自噬和炎症联系在了一起。

结果概览

先来看看摘要，以快速理解文章结构。

首先交代背景，之前已经有研究发现自噬相关基因Atg16l1的SNP位点和炎性肠病有关，但具体是什么机制，目前还不清楚，顺便提出问题。然后提出结果，回答问题，一般会用3-4句话。最后再总结下意义，拔高自己，说明研究意义。

然后再看看文章的结果。作者用了8张图，可以分成4个部分。

• Fig1阐述现象，小鼠T细胞选择性敲除自噬相关基因Atg16l1导致自发性肠道炎症；

• Fig2-3验证Atg16l1的功能；

• Fig4-5解释细胞机制，Atg16l1对肠粘膜Treg的存活有显著影响；

• Fig6-7中换了个转基因动物模型，在Treg中敲除目的基因，进一步证明了基因对Treg的影响；

• Fig8中做了个简单的分子机制。

Fig1 T细胞选择性敲除Atg16l1导致动物自发性肠道炎症疾病

首先验证模型，通过流式检测发现，敲除了Atg16l1后小鼠CD4+T细胞自噬体形成受到阻碍。

Fig1B做了个自噬的Marker，LC3 II，其积累代表了自噬程度的增加，说明模型是成功的。

Fig1C中做了小鼠的体重曲线，显示五月龄后体重进入平台期（发病），因为炎性肠病会影响消化。Fig1D、E显示Atg16l1敲除的小鼠表现为脾脏和淋巴肿大。

接下来用免疫组化的方式检测了炎性肠病的病理特征，主要有4个方面：

a.小肠长度增加；

b.隐窝深度增加；

c.肠绒毛变短；

d.肠上皮细胞增生。

这就是炎性肠病的套路，如果要看建模后有没有炎性肠病的特征，就要看看体重，脾脏和淋巴结的大小，以及病理特征。

Fig2 说明症状产生的原因

Fig2A首先检测了模型中CD4+T细胞，主要检测了4个组织，脾脏、肠系膜淋巴结、结肠固有层淋巴细胞、小肠固有层淋巴细胞，发现是显著减少的。而Fig2B、C中说明的是同一个问题，辅助性T细胞亚群的变化情况，Fig2B是比例，Fig2C是绝对数量。由此找到辅助性T细胞亚群的主要变化是Th2。

Fig2D图是个流式细胞结果，Fig2E是它的统计结果，重点是这个。

这里用了两个特异性Marker，Th2的Gata3和Th17的IL-17A，发现转基因老鼠中，Th2细胞显著增加，而且主要增加在结肠固有层里。

同样的方法，在Fig2F、G中研究了Treg细胞，发现转基因小鼠中，Foxp3+ Treg细胞显著减少。

Fig3 补充体液免疫的变化

Fig3A中，敲除了Atg16l1后，小鼠血清免疫球蛋白IgE表达显著上调（ELISA法），Fig3B中，给出了小鼠血清免疫球蛋白IgG各亚型、IgA、IgM变化情况。在Fig3C中给出了小肠派伊尔结（Peyre’s Patch）的HE染色图片，主要有B细胞和T细胞。

作者在Fig3D、E、F中尝试给予外源的抗原刺激，包括抗软磷脂抗体（Fig3D）。Fig3E中，小鼠喂食鸡卵清白蛋白或加霍乱毒素处置后IgE显著增高。Fig3F小鼠用来源于菌群的鞭毛蛋白抗原刺激，IgG1和IgA显著增高。

总而言之，Fig3是个补充结果，只是给出了细胞免疫对于体液免疫的影响。

Fig4 敲除Atg16l1对小鼠肠固有层Treg细胞存活有显著影响

Fig4A-C中，作者从Atg16l1^ΔCD4 和对照小鼠中分离naïve CD4+ T细胞进行诱导分化，发现，是否敲除Atg16l1对细胞分化后形成的Th2和Treg都没有影响。说明敲除Atg16l1对Th2和Treg的影响不是通过分化。

Fig4D中，用IL-4，IL-13刺激Atg16l1^ΔCD4 和对照小鼠中分离Foxp3+ Treg细胞，无显著差异。这是考虑Th2细胞分泌的因子可以负调节Treg，进行排除。

在Fig4E、F中，基因敲除小鼠和对照小鼠中分离naïve CD4+ T细胞进行长期诱导， Th2明显升高，Treg显著减少。接下来补充凋亡检测。

Treg凋亡率显著增加， Th2影响不显著

这篇文章到这并没有进一步解释Th2细胞怎么上升的，接下来把所有的问题聚焦到了Treg。

Fig5 Atg16l1小鼠移植野生型pTreg细胞无法逆转Th2变化

Fig5A中作者选择幼年的基因敲除小鼠过继性输入pTreg细胞后脾脏，肠系膜淋巴结和结肠固有层淋巴细胞的CD4+T细胞中CD45.1+与CD45.2+细胞比例分布，cLP中CD45.1+有生存优势，其中pTreg——外周调节性T细胞，主要位于肠道粘膜，可抑制Th2细胞免疫反应。

Fig5B中过继性输入pTreg细胞脾脏，肠系膜淋巴结和结肠固有层淋巴细胞的Foxp3+Treg细胞中CD45.1+与CD45.2+细胞比例分布。

由此作者得出结论：成功在Atg16l1^ΔCD4回复Treg细胞

那回复后对Th2有没有影响呢？

Fig5C-E的结果说明，小鼠过继性输入pTreg细胞后结肠固有层淋巴细胞中Th2、Th1和Th17 细胞比例，CD45.2的Th2比例较高，Th1比例较低，源于cLP中Th2的激活。

Fig5F-H中小鼠过继性输入WT pTreg细胞不能逆转肠道炎性病理反应，IgE依然显著增高，推测Th2细胞上升并非受到Treg影响，是内源性作用。可以看到，这些就是前面做过的实验……全是套路啊。

Fig6在Treg中敲除Atg16l1与Th2中敲除的表型一致

从Fig6开始，作者其实做的东西和前面一样，就是换了个Treg小鼠模型。在野生型老鼠中，Foxp3+ Treg细胞的自噬水平显著高于Foxp3-CD4+ T 细胞，提示Treg对自噬有依赖。

接下来Fig6C-F都是前面做过的实验，很简单。敲除了Atg16l1基因的小鼠，在五个月后发生严重炎症性疾病症状，包括体重减轻，脾脏和淋巴肿大，小肠长度增加，以及多组织的白细胞侵润。

Fig7 看了小肠和结肠中的炎性情况

Fig7A做了小肠和结肠的CD3染色荧光图片，CD3 (red)、b-catenin (green)、 DAPI (blue)。而在Fig7B、C中检测了结肠固有层淋巴细胞中CD4+TCRβ+ T细胞比例和数量，这个前面也做过。

接下来的这些图，前面也见过，不过作者为了简化数据，有些前面选了4个组织，这次就做了肠系膜淋巴结和结肠固有层淋巴细胞，看一下效应性T细胞的比例，Th1、Th2、Th17细胞比例和数量，脾脏、肠系膜淋巴结和结肠固有层淋巴细胞中Gata3 CD4+ T细胞比例，以及血清中免疫球蛋白IgE含量。都是重复的方法。

Fig8展示了老鼠的糖脂代谢水平显著改变

模型老鼠脾脏、肠系膜淋巴结和结肠固有层淋巴细胞中Treg细胞在 CD4+ TCRβ+ T细胞所占比例显著减少，而胸腺无差异。那怎么和糖代谢、脂代谢联系起来呢？很简单，作者对糖脂代谢相关分子做了qPCR检测。

年轻的模型老鼠脾脏和结肠固有层淋巴细胞的Treg中分析糖代谢相关基因表达。

同样的，年轻的模型老鼠脾脏和结肠固有层淋巴细胞的Treg中分析脂代谢相关基因表达。

套路解析

根据全文分析疾型模法标可以看到以下套路性的内容：

疾病：炎性肠病（IBD）

表型：自噬、炎症、Treg / Th2

模型：Atg16l1^ΔFoxp3KO老鼠、Atg16l1^ΔCD4KO老鼠

检测方法：流式细胞检测、组织学检测、qPCR等

分子标记：Th2细胞表面标记、Treg细胞表面标记、糖，脂代谢分子标志

分子：Atg16l1

前5者是衡量，最后的分子就是变量，可以换成其他分子就又是一篇文章了，还能在这套路上进行深化，加入分子机制，包括和已知分子或者明星的关系。