一文了解 “单细胞测序技术”

单细胞测序技术自2009年问世，2013年被Nature Methods评为年度技术以来，越来越多地被应用在科研领域。

2015年以来，10X Genomics、Drop-seq、Micro-well、Split-seq等技术的出现，彻底降低了单细胞测序的成本门槛。

自此，单细胞测序技术被广泛应用于基础科研和临床研究。单细胞在许多领域都占有一席之地，对于癌症早期的诊断、追踪以及个体化治疗具有重要意义。

发展路程

development

从2009年开始，北京大学汤富酬教授在博士后期间发表了世界第一篇单细胞mRNA测序的文章，引起了业界广泛关注。在2009年之前，我们只能通过显微成像或者流式细胞技术进行细胞水平的研究。然而，通过显微镜观测或者HE染色、免疫组化、免疫荧光等技术可观察的细胞数量有限，通常为几个到几十个，而且观察到的靶标数量也低。流式细胞术可以高速分析上万个细胞，并同时从一个细胞中测得多个参数，但参数类型比较局限，且数量也有限。

高通量时代到来

通过单细胞测序技术，可以进行单个细胞的捕获、裂解、mRNA 富集建库和 NGS 测序等流程，实现了单细胞水平的全转录组测序。但一开始进行单细胞测序，是将单个细胞分离出来，独立构建测序文库的方法来进行，如有限稀释法、显微操作法、激光显微切割、流式细胞术等。受细胞分离技术和高昂成本所限，这些单细胞测序技术只能检测少量的细胞（几十到几百个）。但随着测序技术的深入研究，出现了基于barcode标签的单细胞识别，伴随着Drop-Seq、Cyto-Seq等基于微滴或微孔的新型单细胞分离技术的出现，使得单个细胞分离和捕获测序的成本大大降低，单细胞转录组测序进入了高通量时代。

在单细胞转录组测序技术快速发展的同时，单细胞多组学技术也在迅猛发展。所谓单细胞多组学就是指在同一个细胞内同时检测两种或两种以上的组学，如单细胞转录组与单细胞ATAC联合检测，以及单细胞转录组、免疫组库、表面蛋白同时检测等。

目前，单细胞多组学检测已包含转录组、基因组、表观组、免疫组、蛋白组等多个组学方面，为单细胞水平上的研究提供了更全面、更精细、更完整的分析策略。与其他传统测序技术（如基因组学测序、常规转录组测序）相比，单细胞测序仍处于起步成长阶段，但它在科研以及转化中的应用已经非常广泛。例如在新冠疫情中，单细胞测序技术已被广泛应用于新病毒的人体器官易感性和感染性损伤研究，以及治疗性和预防性抗体的筛选工作。

随着单细胞技术的不断成熟优化以及分析软件的开发，相信单细胞技术未来会实现更加广泛的应用。

初次听说单细胞测序技术，单细胞测序又是什么噱头？如果单细胞测序就能测一个细胞或几个细胞的话，这有什么意义？特别是对异质性高的肿瘤组织来讲，测一个细胞能代表什么？

无论是蠕虫，蓝鲸，还是人类，自然界所有的多细胞生命都是从单个细胞发育而来开始。这样一个单细胞，鬼斧神工地构建出有机生命体所需的各种组织、器官、系统。每个新细胞在正确的时间，在正确的地方分裂、分化，并与相邻细胞协调精准发挥功能。

多细胞生命的发育过程，是自然界中最引人注目的壮举之一。尽管经过数十年的研究，生物学家仍然无法完全理解这一过程。

2018 年 4 月 26 日，Science 杂志发表三篇超重磅研究，来自哈佛医学院和哈佛大学的研究人员使用多种技术组合，包括对发育中斑马鱼和青蛙胚胎数千个单细胞的基因测序，以精确的方式跟踪和描绘了组织和整个机体从单细胞发育的完整历程。哈佛大学分子和细胞生物学教授 Alexander Schier 表示，“这几乎就像通过几颗星星看到了整个宇宙。”

对于多细胞生物来说，细胞与细胞之间是有差异性的(cell heterogeneity)。这种差异性可以体现为不同的遗传背景，不同的分化状态，不同的物理特征 ，不同的基因突变谱和转录组、蛋白质组表达谱等。这些差异可以帮助我们理解和研究不同细胞的临床生理表现。例如具有高度多样性肿瘤细胞。肿瘤在发生发展过程中，细胞持续产生新的突变而形成了许多亚细胞群，由于它们不同的免疫特性，生长速度以及转移能力等方面的差异，使得对药物或者放疗的临床反应有所不同。传统的研究中，大家往往根据细胞的物理形态或者marker genes来区分不同的细胞种类，对比之下单细胞测序则更加精确，大大提高了细胞差异性研究的分辨率。

这些发现就好比是勾勒出胚胎发育过程中产生不同细胞类型的遗传“配方”目录，为发育生物学的深入研究和疾病的认识，提供了前所未有的资源。

“通过单细胞测序，我们可以在一天的时间里概括数十年来对细胞在生命早期阶段分化的艰苦研究。”哈佛医学院系统生物学助理教授 Allon Klein 表示，“通过我们开发的方法，我们正在绘制我们认为发育生物学的未来，发育生物学将会转变为定量的、大数据驱动的科学。”

Alexander Schier 表示，除了对生命早期阶段有所了解之外，这项工作还可以为大量疾病的新认识打开大门。“我们预见，任何复杂的生物学过程，只要是细胞随时间改变了基因表达，都可以使用这种方法重建，不仅仅是发育中的胚胎，还有癌症发生或大脑退化。”

单细胞测序的流程

单细胞测序的流程一般包括：单细胞悬液制备、单细胞分选、文库制备、高通量测序和生物信息分析。

单细胞悬液制备

在单细胞悬液的制备过程中，外周血、胸水、腹水等样本不需要经过消化，直接通过离心或者沉降即可获得单个细胞的悬液；而对于固体组织，需要根据组织类型采用不同的酶进行消化，使组织块解离成单个细胞。

悬液的制备并不困难，关键是要制备出高质量的悬液。悬液中细胞的活性、结团率、背景复杂程度等指标都关系着最终测序数据质量，需要实验人员小心操作，有需要时可用细胞筛、去死细胞试剂盒等步骤提高最终上机前的悬液质量。

单细胞分选

单细胞悬液制备完成之后，即可进行单细胞的分选标记。单细胞的分选标记方法有很多种（图4），高通量分选方法大致分为基于微流控技术的微滴包裹单细胞（Drop-Seq，InDrop，10x Genomics等）、基于微孔阵列的单细胞分隔技术（BD Rhapsody，Singleron等）以及其他原理的技术（SPLiT-Seq等）。

文库制备

为了对扩增的DNA进行测序，首先需要将其制成一个测序文库。测序文库是来自一个细胞群的单链DNA片段的集合，或者在单细胞测序的情况下，来自一个特定的细胞。

扩增后，DNA片段被唯一的条码化，以识别它们属于哪个起始细胞，并在5'和3'端添加特定的适配序列。

需要测序的DNA部分通常被命名为插入物，条形码和适配体在插入物的一端或两端加盖，属于同一测序库的所有DNA片段都使用相同的寡核苷酸序列进行条码化。

这允许在同一测序过程中把不同的文库集中在一起进行测序，适配体取决于平台，需要对片段进行测序。

测序分析

将单细胞分开标记上特殊的标签之后，就可以进行建库测序以及后续分析。各大厂商也针对自己的单细胞开发了相应的分析平台（如对接10x Chromium的Cell Ranger等），解决了初期的数据分析需求，但由于单细胞数据的体量大以及分析内容的复杂性，并不能满足所有需求，因此，研究人员也大量开发了各种单细胞生物信息分析软件和流程供其他研究者们使用。

单细胞测序的类型

单细胞测序技术可以测量不同类型的遗传物质，单细胞的基因组、转录组或甲基组。

单细胞基因组测序

通过确定单细胞的基因组，scDNA-seq可以对细胞群的基因组异质性进行研究。因此，它主要用于研究微生物组和癌症。微生物组是单细胞生物的社区，scDNA-seq测量其微生物成分的基因组，而不需要先分离和培养它们。

然后，测序数据可用于研究微生物组的组成，从而研究其生态学、进化和改变。

在癌症研究中，scDNA-seq被用来研究肿瘤内的遗传异质性或识别新型致癌突变。由于这些创新能力，scDNA-seq大大促进了精准医疗的发展。

对于scDNA-seq，从分离的细胞中提取的DNA最常使用多重置换扩增法（MDA）或多重退火和循环扩增循环法（MALBAC）。

MDA允许快速扩增微量的DNA，提供一个优秀但不均匀的基因组覆盖。另一方面，MALBAC提供的基因组覆盖率较低但更均匀，因此更适合检测拷贝数变异。

如前所述，库是由扩增的DNA生成的。为了使这种方法成功，均匀和有效的扩增是至关重要的。

然而，没有一种扩增方法是无懈可击的。特别是检测单核苷酸多态性（SNPs）和拷贝数变异的效率往往很低。因此，不同的扩增方法已经被开发出来，以改善对特定突变类型的检测。

单细胞转录组测序

scRNA-seq测量给定样本中每个细胞内的RNA分子。这一信息提供了细胞收获时转录组（正在转录的基因）的快照。

自从开发以来，scRNA-seq已经发现了大量的应用，虽然一个基因表达的最终产品是蛋白质，但检测其信使RNA（mRNA）表明该基因被打开，因此，有可能随后被翻译和表达。

此外，共同转录的基因可用于推断特定细胞表型所依据的基因调控网络，细胞群的转录差异可以帮助识别亚群，如肿瘤块的恶性细胞。

scRNA-seq也被用来研究重要的基因转录特征，如剪接模式和单倍体基因转录。由于细菌细胞中mRNA拷贝数低和RNA不稳定等因素，原核生物scRNA-seq一直是个问题。然而，这些问题正在逐渐被克服。

单细胞DNA甲基组测序

DNA甲基化涉及到将一个甲基转移到一个胞嘧啶碳（通常是C5）上。甲基化是一种表观遗传机制，它改变了DNA的活性而不影响其序列，当在基因启动子中时，DNA甲基化通常会抑制该基因的转录。

因此，单细胞DNA甲基组测序（scDNA-Met-seq）可以用来研究在一个原本基因相同的细胞群中的表观遗传变化，引起不同的表型。

DNA甲基化对细胞身份也至关重要，是X染色体失活、基因组印记、可转录元素的压制、衰老和致癌的关键。这项技术主要用于发育研究，但也被用于探索罕见的和极其活跃的肿瘤细胞亚群。

单细胞测序的应用

单细胞测序技术，是在单个细胞水平上，对基因组、转录组、表观组进行高通量测序分析的一项新技术。它能够揭示单个细胞的基因结构和基因表达状态，反映细胞间的异质性，在肿瘤、发育生物学、微生物学、神经科学等领域发挥重要作用，正成为生命科学研究的焦点。

单细胞测序在肿瘤研究中的应用

癌症细胞研究是单细胞测序首先应用的领域。对乳腺癌单细胞测序分析的研究结果揭示，肿瘤生长是由少量持久中间体和克隆导致的。对肾肿瘤单细胞测序分析，没有发现明显的细胞亚群，肿瘤细胞之间的突变频率和突变位置也不尽相同，这表明肾肿瘤具有异质性，其治疗需要开发更加有效的细胞靶向疗法。这也为研究肿瘤的发展机制和转移机制提供了参考。

有研究报道，单细胞测序会增加基因表达值测量时的噪音，但通过分析不同细胞类型中微量个体细胞表达情况，是可以鉴别出许多存在表达差异的基因，也能够发现循环系统肿瘤细胞中的活跃基因，以及肿瘤细胞不同的表达模式和候选标记。此外，有研究发现，口腔鳞状细胞癌对常规放化疗的抵抗可能是由肿瘤干细胞所导致。

单细胞测序在发育生物学中的应用

单细胞测序使得通过单个细胞，来研究个体发育成为可能。有研究表明，人和小鼠胚胎发育每个阶段都可以被少量由共表达基因组成的功能模块准确区分，这表明细胞循环(分裂到桑椹胚阶段)、基因调控、翻译和代谢中的转录谱以一定顺序变化着。

对生殖细胞的单细胞全基因组高通量测序，得到高密度基因分型结果，绘制个人水平的染色体重组图，发现低分辨率情况下结果与种群数据一致，但在高分辨率下却表现出不同，这些差异表明个体特征可能在群体范围内被稀释。对体外胚胎内细胞团向胚胎干细胞转化的研究中，发现包括新陈代谢基因在内的分子和转录本可变剪切均发生了显著变化，这有利于研究疾病组织中成熟细胞转变发生的机制。

单细胞测序在微生物研究中的应用

单细胞测序使得微生物研究得到发展。传统的测序方法无法对自然界中不易培养微生物进行测序，单细胞测序则区别于宏基因组研究，可以对单个微生物细胞进行分析，进而发现新的微生物物种，构建新的微生物进化树和微生物基因组序列，加深科学家对微生物生命活动过程的理解。

对不能人为培养的海洋微生物进行测序分析后，发现硫氧化、氧化呼吸、二氧化碳固定过程中的关键酶，并发现海洋微生物可能利用无机硫化物和二甲基亚砜作为电子受体。新基因的发现有助于研究人员对微生物分类、进化和生命活动的探索。

随着精准治疗时代的到来，未来单细胞技术，将会有助于人类的科学研究以及临床应用，尤其是在肿瘤、微生物、神经科学、免疫学等领域，应用会越来越广泛。

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图文编辑｜Anty