为什么研究线粒体
线粒体在健康和疾病中发挥着关键作用，不仅是能量产生的关键，还有很多其他功能 [1]：
离子稳态：从铁和钙的稳态到激素和神经递质的产生，都离不开线粒体。特别是在钙稳态中，线粒体作为调节者、缓冲池和传感器参与细胞内钙信号传导。线粒体可以储存和释放钙，从而影响细胞质中钙峰值的形状、频率和幅度，这对于各种细胞过程都紧密相关。
胞内、胞外交流：线粒体与其他细胞器和环境相互作用，影响各个生理层面的交流。线粒体是细胞间通讯的核心，在复杂的调节活动和细胞间通讯中充当信号细胞器。线粒体与细胞核之间的信号转导通路，在细胞稳态中扮演关键角色。
免疫系统：线粒体可调节免疫细胞的功能及其对感染的反应。线粒体负责产生免疫细胞激活、增殖和行使功能所需的能量。线粒体还参与活性氧的产生，这对于免疫细胞的抗菌能力相当重要。此外，线粒体还参与免疫细胞死亡和炎症的调节。位于线粒体外膜上的线粒体抗病毒信号蛋白（MAVS）在病毒感染的免疫反应中至关重要。因此，线粒体健康与免疫系统功能息息相关。
肠道微生物群：肠道微生物群可以影响线粒体新生，从而影响能量产生和其他线粒体功能。线粒体可以通过产生活性氧和其他代谢物来影响肠道微生物群的组成。线粒体和肠道微生物群之间的这种相互作用对于维持肠道健康来说是非常重要的，并且与多种疾病有关，包括代谢综合征、炎症性肠病和神经退行性疾病。
生物钟：据文献报道，线粒体活动和动态会影响昼夜节律，并且线粒体与昼夜系统相互作用以调节 NAD+ 等关键分子的生物合成。
线粒体功能障碍与疾病的关系
线粒体功能障碍与多种疾病相关，包括代谢综合征、神经系统疾病、癌症、心血管疾病、传染病以及炎症性疾病，下面是几个例子：
代谢综合征：线粒体功能障碍可能导致代谢综合征，这种疾病的特征包括高血压、高血糖和胆固醇水平异常等一系列症状，这些疾病会增加患心脏病、中风和二型糖尿病的风险。
神经系统疾病：线粒体功能障碍与阿尔茨海默病、帕金森氏症和肌萎缩侧索硬化 (ALS) 等神经系统疾病有关。线粒体功能障碍可能导致能量产生减少和活性氧产生增加，从而导致神经元损伤。
癌症：线粒体代谢的改变可能导致癌症的发生和发展。线粒体功能障碍会导致活性氧产生增加，从而导致 DNA 损伤和突变，促进癌症的发展。
心血管疾病：线粒体功能障碍可能会损害心肌产生能量的能力，从而导致心脏疾病，包括心力衰竭、心律失常和其他心血管疾病。
炎症性疾病：线粒体功能障碍可引发慢性炎症，导致各种炎症性疾病的发展，包括自身免疫性疾病。
线粒体研究的工具
线粒体形态&定位研究
根据样品类型和具体应用，线粒体结构标记汇总如下：
MitoTracker 标记探针
MitoTracker 探针是小分子 (<1 kDa)、细胞渗透性线粒体选择性染料，含有硫醇反应性氯甲基，部分探针可在固定后保持染料与线粒体结合。由于探针与线粒体硫醇形成共价键，因此它们只能用作终点测定，以检测活细胞的线粒体膜电位，不能随时间动态检测线粒体膜变化。
图1. 在A549细胞中使用 MitoTracker™ Red CMXRos (货号 M7512) 染色线粒体
CellLight荧光融合蛋白
当需要在活细胞中不依赖于膜电位标记线粒体并跟踪细胞的行为动态时，推荐使用 CellLight 试剂，操作简单、可与其他试剂共用，也可以固定。
图2. 在HeLa细胞中使用CellLight™ Mitochondria-GFP (货号C10600) 标记线粒体
线粒体蛋白抗体
线粒体标记抗体特异性检测线粒体蛋白，可以帮助研究线粒体的形态和动力学以及其他相关的生理病理状态。常见的线粒体靶点有细胞色素c氧化酶（COX），氢离子转运ATP酶线粒体F1复合体，热休克蛋白60，抗增殖蛋白Prohibitin等。
图3. 在印度麂鹿皮成纤维细胞中用小鼠抗 OxPhos Complex V 抑制剂蛋白抗体标记线粒体，搭配二抗 Alexa Fluor™ 555 山羊抗小鼠 IgG (货号 A21422)
线粒体功能分析
线粒体的损伤包括线粒体氧化还原电位和膜电位的变化，后者是线粒体健康的一个核心特征。
线粒体内膜电位对Ca2+的吸收和储存、活性氧的产生和解毒作用至关重要，其中最重要的是氧化磷酸化合成ATP [2]。
因此，膜的去极化是评价线粒体功能障碍的良好指标，这与药物毒性的相关性越来越高 [3-7]。
膜电位的变化，以及ATP与ADP比率的降低、线粒体基质钙水平的增加、氧化应激和胞质细胞色素c的释放均被认为与线粒体膜通透性转换有关，线粒体膜通透性转换孔 (MPTP) 可以改变离子和小分子的稳态。
线粒体功能的破坏可以使用各种荧光试剂盒来检测，包括线粒体钙、超氧化物、线粒体膜通透性转换和膜电位的检测。
线粒体膜电位动态变化的检测
线粒体膜电位的终点检测
线粒体超氧化物生成的检测
细胞超氧化物生成的增加与多种疾病状态有关 [8]。它是氧化磷酸化的副产物，因此提供了另一种评估线粒体健康和细胞状态的方法。
图4. 在U2OS细胞中用MitoSOX™ Green (货号M36005) 检测线粒体超氧化物
线粒体钙离子检测
线粒体Ca2+ 浓度升高在启动程序性细胞死亡（凋亡）以及其他细胞水平的过程中起着重要作用 [9]。荧光探针在结合Ca2+ 时表现出光谱响应，使研究人员能够使用荧光显微镜、流式细胞分析和荧光光谱法研究细胞内游离Ca2+ 浓度的变化。
图5. 线粒体钙水平和动力学的多参数成像。（A）用CellLight Mitochondria-GFP和5μM Rhod-2 AM在37℃下标记HeLa细胞15分钟，成像时间超过100秒。（B–D）为区域（A）放大的图像，展示随着时间的推移，单个细胞内的单个线粒体。（C，D）当用10μM组织胺处理后，钙从内部被释放出来。Rhod-2橙红色荧光的增加揭示了线粒体紧邻钙释放的位置。（C）中的箭头表示线粒体可能损害了钙吸收，如果单独使用Rhod-2 AM检测，可能会遗漏这一细节。星号表示单个线粒体，显示钙水平暂时升高。
线粒体膜通透性转换孔变化的检测
线粒体膜通透性转换孔 (MPTP) 是位于线粒体内外膜的非特异性通道，研究表示，参与细胞死亡过程中线粒体成分的释放。MPTP的开关极大地改变了线粒体的渗透性以及线粒体膜电位。这种持续孔隙激活是由线粒体Ca2+ 超载、线粒体谷胱甘肽氧化、线粒体活性氧水平升高和其他促凋亡条件引起的。
参考文献（上下滑动查看更多）：
1) Casanova, A., Wevers, A., Navarro-Ledesma, S., & Pruimboom, L. (2023). Mitochondria: It is all about energy. Frontiers in Physiology, 14. https://doi.org/10.3389/fphys.2023.1114231
2) Nicholls, DG (2004) Mitochondrial Membrane Potential and Aging. Aging Cell 3: 35-40.
3) Tirmenstein, MA, Hu, CX, Gales TL, et al.(2002) Effects of Troglitazone on HepG2 Viability and Mitochondrial Function Toxicol. Sci.69: 131-8.
4) O'Brien PJ, Irwin W, Diaz D, et al.(2006) High Concordance of Drug-Induced Human Hepatotoxicity With in Vitro Cytotoxicity Measured in a Novel Cell-Based Model Using High Content Screening. Arch Toxicol 80: 580-604.
5) Dykens JA, Will Y. (2007) The Significance of Mitochondrial Toxicity Testing in Drug Development. Drug Discovery Today 12:777-85.
6) Dykens JA，Jamieson JD，Marroquin LD，et al .(2008) In Vitro Assessment of Mitochondrial Dysfunction and Cytotoxicity of Nefazodone, Trazodone, and Buspirone. Toxicol Sci 103: 335-45.
7) Abraham VC, Towne DL, Waring JF, et al.(2008) Application of a High-Content Multiparameter Cytotoxicity Assay to Prioritize Compounds Based on Toxicity Potential in Humans. J Biomol Screen 13: 527-37.
8) He L, He T, Farrar S et al.(2017) Antioxidants Maintain Cellular Redox Homeostasis by Elimination of Reactive Oxygen Species. Cell Physiol Biochem 44: 532-553.
9) Giorgi C, Romagnoli A, Pinton P et al.(2008) Ca2+ Signaling, Mitochondria and Cell Death. Curr Mol Med 8: 119-130.
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