【论肿道麻】抗氧化剂与活性氧在肿瘤中的复杂相互作用
活性氧（ROS）在组织内稳态、细胞信号传导、分化和存活中发挥重要作用。2020年，Isaac S. Harris等人在《Trends in Cell Biology》杂志上发表了题为《The Complex Interplay between Antioxidants and ROS in Cancer》的综述，介绍了ROS的类型及其在促癌和抗肿瘤中的作用，并讨论了对肿瘤发生过程中内源性和外源性抗氧化剂的最新进展，以及转录因子NFE2相关因子2（NRF2）异常激活抗氧化程序对肿瘤发生和转移的影响。现介绍如下：
ROS是指包含并参与活性氧电子转移的分子，在组织内稳态中发挥重要作用，调节信号传导、分化、促进细胞损伤和死亡，其水平受细胞抗氧化防御系统的严格调控。虽然ROS通常聚在一起，但ROS是一类不同的分子，对细胞过程的影响复杂，既有促癌作用，也有抗肿瘤作用。活性氧的不同形式、来源和主要目标见图1。
作为由分子氧与线粒体电子传递链复合体I/III经电子转移反应得到的一类物质，超氧阴离子（O2-）活性中等。在超氧化物歧化酶或不涉及酶作用的情况下，其很容易被歧化成过氧化氢（H2O2）。由于其带有负电荷，因此无法经膜扩散。此外，某些类型的细胞（如中性粒细胞）也能够通过NADPH氧化酶产生大量的胞外O2-。在细胞中，它能够直接作用于铁-硫（Fe-S）簇进而释放出Fe。此外，O2-还可与一氧化氮（NO）反应生成过氧亚硝酸盐（ONOO-）。而ONOO-与蛋白质反应能够导致氨基酸的氧化或硝化，引起DNA双链断裂，诱发脂质发生过氧化反应。 作为机体O2-的代谢产物，尽管H2O2同样具有中等活性。作为内质网（ER）中氧化蛋白质折叠过程中的一种代谢产物，H2O2也可由Ero1产生，可经膜扩散，是蛋白质氧化反应的主要活性氧参与者。低水平（1-10 nM）的H2O2在氧化氧化还原信号中起重要作用，而高水平（100 nM）会引起氧化应激。 由于O2-和H2O2均为中等活性，因此大多数源于ROS的细胞损伤均是由其代谢产物所引起。其中，氢过氧自由基（OH·）由H2O2生成，是所有ROS中活性最强的代谢产物，在芬顿反应中能与铁离子（Fe2+）反应生成OH·。此外，O2-还可通过将Fe3+还原为Fe2+来促进OH·的形成。 由于含有碳碳双键（不饱和键），多不饱和脂肪酸（PUFA）含有对脂质过氧化反应极为敏感的活性氢原子，对胞内脂质双层的完整性非常重要。OH·能引发脂质过氧化，导致脂质自由基和脂质过氧化自由基形成，与PUFA在增殖反应中反应生成过氧化脂质。过度的脂质过氧化与铁依赖的细胞死亡形式之间存在密切相关相，即所谓的“铁死亡”。 ROS通过氧化核酸碱基来诱导DNA损伤。修复这些改变的碱基会导致突变。辐射是最广为人知的活性氧来源之一，也是肿瘤发生发展的一大诱因。ROS还可通过影响蛋白质功能来改变细胞过程（见图2）。ROS的作用与蛋白质氧化程度密切相关。温和的氧化反应过程能够促进细胞信号传递，通常是可逆的，允许蛋白质活性和信号网络快速变化。过度氧化会导致末端氧化（磺酸）和蛋白质功能完全丧失。虽然不可逆的半胱氨酸修饰对蛋白质功能有害，但可逆的修饰可以在应激期间起保护作用。由于蛋白质修饰能够通过激活抗氧化剂（KEAP1）或代谢（GAPDH、PKM2）程序来促进ROS代谢，因此能够在适应氧化应激中发挥关键性作用。此外其他可逆的修饰也可内源性发生，包括结合作用和谷胱甘肽基化，既可保护蛋白质免受末端氧化，又可改变它们的功能以促进新陈代谢重连。
抗氧化剂是指一类能够参与ROS清除过程的酶或辅助因子（见图3）。其中最丰富的内源性抗氧化剂是代谢辅因子谷胱甘肽（GSH）。作为三肽，GSH通过两步过程合成。第一步，谷氨酸-半胱氨酸连接酶催化亚基（GCLC）催化谷氨酸和半胱氨酸发生缩合反应；第二步，谷胱甘肽合成酶（GSS）与甘氨酸结合形成三肽。虽然半胱氨酸在大多数情况下是这一途径的限速代谢物，但谷氨酸和甘氨酸也可限制谷胱甘肽的合成。谷胱甘肽是谷胱甘肽S转移酶（GST）和谷胱甘肽过氧化物酶（GPX）清除活性氧的辅助因子。GST和GPX酶由多个家族和异构体组成，并且尚不清楚每种酶的确切靶标。除了依赖于GSH的抗氧化系统外，硫氧还蛋白（SRX+TXN）抗氧化网络还能再生出一类对H2O2具有高催化活性的过氧化物氧化还蛋白酶（PRDX）。与丰度较高的GSH代谢物不同，TXN是一种小蛋白抗氧化剂，含量较低。TXN体系可还原PRDX的二硫键，而SRX则可以对PRDX（其被过氧化为亚磺酸）进行还原。不同但高度同源的PRDX和TXN蛋白定位于线粒体或细胞质，但每个亚细胞系统的相对重要性以及它们之间的串扰尚不清楚。氧化型GSH和TXN均由还原酶以NADPH为电子供体再生。无论是正常组织还是恶性组织中，这些途径都是互补的。氧化损害能够起到促进GSH和TXN系统中酶表达过程，表明它们之间在缓解氧化应激方面可能存在协同作用。 内源性抗氧化剂在肿瘤中的作用很大程度上取决于肿瘤发生的阶段。抗氧化剂通过阻止ROS诱导的DNA氧化和随后的DNA损伤，在预防肿瘤发生方面发挥着重要作用。抗氧化系统参与致癌物的解毒，因此其在阻止ROS诱导的肿瘤发生中的直接作用尚不清楚。相比之下，抗氧化蛋白在肿瘤进展中能够发挥极为重要的作用。
通过对ROS的清除，抗氧化剂可在预防机体损伤或癌变方面发挥一定的作用。GPX在多种模型中已被证实防止致癌物和ROS诱导的肿瘤发生。其中，在小鼠结肠癌模型中，抑制GPX3能够有效抑制肿瘤发生。SOD2表达降低的小鼠均存在更高的DNA损伤和肿瘤发病率。同样，TXN体系的作用也与上述物质相类似。PRDX1的丢失会导致DNA损伤积累和老年小鼠肿瘤发病率的增加。PRDX1作为PTEN的还原剂抑制肿瘤细胞生长。而PRDX6的缺失则会加速HPV8诱导的皮肤癌发生。GSH和TXN可共同起到肿瘤预防作用，而氧化DNA的积累足以促进小鼠肿瘤发生。在没有任何致癌因素的情况下，恢复DNA中8-氧代脱氧鸟嘌呤的OGG1的丢失能导致小鼠出现自发性肺癌。因此可以看出，内源性抗氧化剂在肿瘤预防中能够发挥重要作用。 GPX能够在肿瘤进展过程中有效清除ROS的产生，尤其GPX4可通过抑制脂质过氧化和铁死亡而发挥其重要作用。细胞的铁死亡过程涉及多个子过程，包括使用抗氧化剂辅助因子泛醌（CoQ10）的GSH非依赖性途径。经历上皮-间充质转化（EMT）的耐药肿瘤细胞对铁死亡更为敏感。TXN体系的组成部分，如TXN和TXNRD1，能够促进肿瘤生长。PRDX1和PRDX4在恶性肿瘤组织中的表达升高，有助于肿瘤的生存，PRDX6过表达还会加速恶性肿瘤进展。超氧化物代谢产物同样在肿瘤进展中起重要作用，通过铜螯合剂抑制SOD1可以阻止肺肿瘤的发生；靶向TXN或SOD1抗氧化系统会损害O2-暴露后肺癌细胞的存活。因此，内源性抗氧化计划将为支持肿瘤的进展和生存能力提供重要的支撑。 动物研究常使用外源性抗氧化剂来治疗肿瘤，并分析胞内ROS物质在各种肿瘤过程中的因果作用。其中使用最为广泛的外源性抗氧化剂为N-乙酰半胱氨酸（NAC）。接受NAC处理的试验组个体能够通过防止DNA氧化和随后的突变事件来抑制由p53缺失导致的淋巴瘤和肺癌的生长。此外，NAC还能起到扰乱HIF1a稳态以及干扰肝细胞异种移植瘤的作用。最近涉及NAC的研究表明，其在一定程度上也会促进肿瘤的发生。通过补充外源性NAC能够促进包括黑色素瘤和肺癌在内的多种基因工程小鼠肿瘤模型的发生、进展和转移。然而补充NAC对细胞氧化还原状态的影响的确切机制尚不清楚。虽然NAC在某些情况下可以促进谷胱甘肽的合成，但其抗氧化功能的主要实现途径是产生硫化氢和蛋白质过硫化。重要的是，蛋白质过硫化物可以被还原以再生未修饰的硫醇。 一方面，抗氧化剂在体内的代谢过程中自身会发生氧化反应，另一方面，抗氧化剂具有非依赖效应，均使得探究其确切功能变得十分复杂。作为常见的抗氧化剂，维生素C（或抗坏血酸）可通过饮食摄入并吸收。最近的研究表明，维生素C会自动氧化成脱氢抗坏血酸（DHA），从而增加细胞内的氧化应激。此外，维生素C还可以通过促进TET2的活性而祈祷负向调节造血干细胞（HSC）的功能的作用。如前所述，NAC可以产生H2S，影响代谢和信号通路。综上所述，在使用外源性抗氧化剂以分析和解释细胞内活性氧对肿瘤生物学的影响时必须持谨慎态度。 在多种肿瘤类型中，抗氧化转录因子NRF2的异常激活是细胞抗氧化程序促肿瘤作用最有利证据。NRF2的水平受到其与KEAP1的关联限制，KEAP1以NRF2为靶标进行蛋白酶体降解。在细胞暴露于氧化或电应激后，KEAP1上的半胱氨酸残基被修饰，导致NRF2泛素化和NRF2积聚受损。NRF2促进抗氧化系统中许多基因的转录。NRF2的积累在肿瘤中很常见，表明抗氧化防御的增强在肿瘤形成过程发挥作用。NRF2在不同类型肿瘤中积聚的机制各不相同，NRF2和KEAP1的突变破坏了NRF2的正常降解。肺癌患者体内存在NRF2外显子跳跃导致KEAP1结合域缺失的情况，同时癌基因驱动的转录可以增加NRF2表达的水平。启动子甲基化、p62介导的螯合作用以及富马酸和甲基乙醛修饰导致的KEAP1失活同样会导致NRF2的积累。 目前，研究人员已针对NRF2在肿瘤发生特定阶段的作用进行了详细分析（见图4）。NRF2与癌基因驱动的肺癌的发生和发展以及p62驱动的胰腺肿瘤的发生和发展之间存在密切相关性。此外，KAEP1缺失增加了由KrasG12D/p53缺失或PTEN缺失和Myc驱动的肝肿瘤负荷驱动的肺肿瘤模型中的肿瘤负担。NRF2的激活与ROS水平的降低和DNA氧化损伤以及代谢过程的激活之间存在一定的相关性。相关研究已经证实，NRF2在抗氧化防御和增殖过程方面涉及多个代谢途径，其中包括PPP和丝氨酸的生物合成，因此其在肿瘤进展的某些阶段可能在抗氧化过程中起主导作用。此外，NRF2的激活会导致系统性半胱氨酸发生广泛变化，这表明NRF2对新陈代谢的影响可能并不局限于直接的转录靶标。
ROS对肿瘤转移的影响复杂，且存在一定的矛盾。研究证明，在很多情况下ROS均能促进肿瘤转移。相反，细胞从细胞外基质（ECM）中分离会导致氧化应激，从而限制循环中的生存，抗氧化剂具有保护和促进转移的作用。NRF2对转移的影响具有高度背景依赖性，并且其可能会受到组织类型、NRF2剂量以及ROS依赖和独立效应的影响。在相同的组织和遗传环境中，KEAP1功能丧失所产生的影响及影响程度也可能依赖于环境。未来还需要进一步的工作来了解特定的LEAP1突变或NRF2激活程度对肿瘤的生长和进展是否存在不同的影响。 综上所述，摒弃ROS和抗氧化剂对肿瘤生物学影响的“一刀切”观点，将有助于调和这些分子在不同研究中似乎相互矛盾的许多影响。本研究的观点也与最近的相关研究相一致，即存在具有不同功能的活性氧池。NADPH氧化酶衍生的ROS可促进肿瘤细胞增殖，而TIGAR缺失引起的ROS则作用相反。NADPH氧化酶产生细胞外O2-，而TIGAR通过支持PPP来保护细胞内免受ROS的伤害。此外，未来在针对抗氧化剂机制解释以及全身基因敲除进行的研究中，需要考虑抗氧化剂程序在微环境中的作用。研究已证实，这些细胞群的功能既依赖于抗氧化程序，也依赖于活性氧的产生。与此同时，要明白ROS在细胞中的有益或有害作用并不一定相互排斥。随着基因筛选技术以及基因组技术等分析方法的进步，人们对对活性氧和抗氧化途径的复杂性的理解一定会逐步加深。 编译：汤洁
审校：张军，缪长虹
原始文献： Harris IS, DeNicola GM. The Complex Interplay between Antioxidants and ROS in Cancer. Trends Cell Biol. 2020 Jun;30(6):440-451.
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