我是如何做分子克隆的

撰文  复旦大学  朱旭国  博士

分子克隆是一个实验室最基本，也是最重要的实验技术，我还记得曾经有位老师和我说过，做好分子克隆就可以轻松做好其它实验了，所以我打算聊一下自己做分子克隆的过程和心得（也是一个被折磨过的灵魂）。

分子克隆的过程大家都知道，我就直接展开到具体的每一步我是怎么做的。

cDNA获取

通常，我们克隆一个基因的所需要的模板主要有几个来源：

1)  直接从体外培养的细胞抽取的RNA逆转录成cDNA后作为模板；

2)  从其它实验室的文库中索取你的目的基因cDNA，我知道的国内比较知名的当属厦门大学韩家淮课题组（百度搜索韩家淮cDNA索取），他们提供的cDNA很容易扩出来，本人已经索取过4-5个基因，在此顺便表示感谢；

3)  从其它实验室索取构建好的质粒，自己可以重新亚克隆到目的载体上，

4)  从addgene网站或者生物公司购买，当然需要付费，公司会更贵一点。

PCR扩增目的基因

有人说这一步最重要的是引物设计，可是我不这么认为，其实扩增目的基因片段我从来不用引物设计软件（可能是我还没遇到难扩增的基因吧），因为引物大体序列已经固定（我通常设计长度就是22bp左右），如果模板是自己逆转录来的cDNA，我建议不妨试试巢式PCR。

酶切、连接和转化

我把这些步骤放在一起是觉得这些可以和PCR扩增在一天之内做完（PCR产物回收可以用PCR产物回收试剂盒），而且没有什么需要特别注意的细节，我大致是酶切2h（我们实验室使用的是NEB公司的限制性内切酶），跑胶后割胶回收。

回收产物做10ul连接体系（质粒和片段比例为1:3-1:10，质粒只需50ng），使用NEB的T4连接酶，室温反应1h就可以接着做转化了。

关于转化（连接体系加到感受态中冰上孵育30min，然后42度热激90s，再置于冰上1-2min），感受态是一个重要的实验材料，我们实验室根据protocol制备的超级感受态效果很好，大家如果根据自己的方法制备的感受态不太好用的话不妨试试这个protocol，我会贴在文末补充材料部分。

阳性克隆鉴定和测序

终于过夜长出克隆了，但是不知道哪个是真正插入了目的片段的阳性克隆，这时候我们可以选择的方法主要有两种：

1)  菌落PCR鉴定，我们可以使用基因片段扩增使用的引物进行菌落PCR鉴定，我一般采取的做法是先挑5个左右的单克隆用300ul左右培养基在1.5ml的EP管中摇到浑浊，然后吸取0.5-1ul作为模板进行PCR反应，大家可以使用2*taq mix，挺方便的。

2)  我们可以抽质粒后进行酶切鉴定，个人觉得这个方法时间太久。

挑出阳性克隆后保险起见可以进行酶切鉴定，但是根据我的经验如果条带比较亮的话可以直接送测序，等测序结果返回后使用NCBI的blast工具做比对确认目的片段是否正确插入到载体了。

到这里，整个载体构建过程算是完成了，当然这只是我个人做分子克隆过程中的操作流程和经验，有些地方写得不是特别详细，如果大家觉得有不对或者不清楚的地方欢迎指正或指出。