辅助生殖技术子代的性别失衡

本文刊登于《中国实用妇科与产科杂志》2023,39(10)：987-991

DOI：10.19538/j.fk2023100107

【引用本文】曹明珠，阿尼古力·沙比尔，米娜瓦尔·吾布力卡斯木，王淑英，刘见桥.辅助生殖技术子代的性别失衡［J］.中国实用妇科与产科杂志2023,39(10)：987-991.

作者：曹明珠1，2，阿尼古力·沙比尔2，米娜瓦尔·吾布力卡斯木2，王淑英2，刘见桥1

通讯作者：刘见桥，电子信箱：[e-mail]

基金项目：国家重点研发计划（2022YFC2702500）；国家自然科学基金（81971452）

作者单位：1. 广州医科大学附属第三医院妇产科生殖中心，广东省产科重大疾病重点实验室，广东省生殖医学重点实验室，广东省妇产疾病临床医学研究中心，粤港澳母胎医学高校联合实验室，广东 广州 510000；2. 喀什地区第一人民医院生殖遗传中心，新疆 喀什 844000

     胚胎植入前遗传学检测 （preimplantation genetic testing，PGT）是在胚胎移植前利用分子生物学技术对胚胎进行遗传学检测，以获得患病风险小的胚胎进行移植。主要适用于染色体异常、单基因遗传病、遗传易感的严重疾病、人类白细胞抗原（HLA）配型、女方高龄、不明原因反复自然流产、不明原因反复种植失败、严重畸形精子症等。该技术主要分为胚胎植入前非整倍体检测（PGT for aneuploidies，PGT-A）、染色体结构重排检测（PGT for structural rearrangements，PGT-SR）和单基因病检测（PGT for monogenic，PGT-M）［1］。PGT使产前诊断提前至植入前胚胎时期，可避免患儿出生以及反复人工流产或引产导致的孕产妇心理和精神创伤，已成为出生缺陷防控的重要技术手段。伴随胚胎培养与活检技术、单细胞高通量检测技术的发展，PGT的临床应用更加广泛，其相关风险也越来越受到重视。本文将从PGT流程、遗传学检测、胚胎活检、伦理风险四方面，对PGT技术相关风险进行讨论。

1  PGT流程相关风险

     PGT涉及胚胎活检、活检样本转运和储存、遗传学检测、结果分析和诊断、遗传咨询等环节，其操作过程复杂、涉及因素和人员较多。因此，从事PGT的实验室机构设置和设备、人员、场所要求参照中华医学会生殖医学分会的“高通量基因测序植入前胚胎遗传学诊断和筛查技术规范（试行） ” ［2］ ，并建立标准的操作流程，做好操作记录、交接记录和差错记录，确保胚胎、活检细胞、活检检测结果一一对应。

    常规体外受精后，胚胎表面可能有颗粒细胞和精子，在进行胚胎全基因组拷贝数检测过程中存在母源颗粒细胞和父源精子DNA污染的风险，导致胚胎检测结果不一致，因此，行PGT的胚胎受精方式一般应采用卵胞浆内单精子注射（intracytoplasmic sperm injection，ICSI） ［3］，并提前去除卵周颗粒细胞［4］。若采用体外受精（IVF），则在受精检查时清洗受精卵，避免母源污染［5］。

    遗传学检测技术是PGT的关键环节。传统的单细胞诊断技术包括聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）和荧光原位杂交技术（fluorescence in situ hybridization，FISH），单细胞PCR技术的主要风险是由目标等位基因选择性扩增带来的等位基因脱扣（allele drop-out，ADO），引起误诊；而FISH仅针对有限数目的染色体进行分析，而不是全部染色体，因此应用受到限制。微阵列技术和高通量测序技术/下一代测序技术（next generation sequencing，NGS）可针对全基因组进行检测，已成为目前常用的检测技术。进行胚胎单基因疾病致病基因携带状态或染色体微重复微缺失检测时，微阵列或NGS技术可以通过致病基因或染色体易位断裂点上下游区间内的单核苷酸多态性（SNP）连锁位点，对胚胎携带状态进行诊断，从而减少等位基因脱扣造成的误诊风险。微阵列比较基因组杂交（array CGH）和单核苷酸多态性微阵列（SNP array）均为微阵列技术，是在芯片表面固定已知序列的基因探针，通过与胚胎基因组扩增产物杂交，检测对应位置的探针信号，实现基因信息的读取和检测。因此，可以检测胚胎全部染色体的非整倍体及片段缺失/重复。但无法检测低于分辨率的微小片段的重复与缺失。SNP array还能用于检测单亲二倍体、三倍体等，一项研究利用已知单倍体和三倍体核型的细胞系对PGT非整倍体囊胚二次活检，用来验证SNP array技术进行PGT的准确性，结果均显示100%一致性，证明了SNP array在异常核型检测的敏感度［6］。目前，单分子测序（single molecule real-time，SMRT）/三代测序技术也逐渐进入临床应用。临床常见单基因遗传病患者无完整家系信息，或家系成员在致病基因上下游连锁分析区域内SNP完全一致的情况，应用常规连锁分析技术无法确定致病基因所在的染色体单体型，从而难以对PGT所获胚胎的致病基因携带情况进行分析。单分子测序不需要对目标DNA进行PCR扩增，因此避免了胚胎遗传物质PCR扩增导致的偏倚［7］，平均读长可达到10kb，最长读长可达到40kb，且覆盖均匀［8］，可解决无完整家系信息的散发型遗传病尤其是合并特殊类型基因突变患者的胚胎植入前遗传学诊断难题，降低因为家系连锁导致的诊断失败或误诊风险。但单分子测序对样本要求较高，有些特殊的染色体区域无法检出，同时存在由于碱基识别错误导致误诊的风险。随着三代测序成本的下降和技术的优化，未来在PGT中有广泛的应用前景。

    各种PGT技术的优势和局限性对比见表1。

2   遗传学检测风险

2.1    嵌合胚胎诊断和移植风险    同一个胚胎中的细胞可能携带不同的染色体，这种现象称为嵌合体。PGT胚胎嵌合风险包括，胚胎活检不可避免的采样偏差导致胚胎误诊风险，以及移植嵌合体胚胎的风险。由于技术和生物学原因，通过活检部分细胞进行遗传学检测来判断整个胚胎的染色体状态都不是100%准确的，存在不确定或假阳性、假阴性的风险。活检细胞染色体嵌合的诊断不能反映整个胚胎的组成或发育潜能，而活检细胞个数、活检方法和技术、检测平台的差异，均可能影响嵌合胚胎的诊断和嵌合比例。

    随着遗传学检测技术敏感度的提高，PGT中可以检出胚胎染色体介于整倍体和非整倍体之间，目前判定嵌合体胚胎的cut-off值仍存在争议。嵌合体胚胎具有成功着床和继续发育的潜能，获得染色体整倍体的健康活产子代［9］。但整体来说，嵌合型胚胎较整倍体胚胎植入率低、流产率高、持续妊娠率低［10］。当临床面对无整倍体胚胎移植的情况时，尤其是卵巢功能低下患者，需充分遗传咨询、知情同意移植嵌合胚胎的风险、并遵循国内外规范指南选择相对可移植的胚胎。患者夫妇充分知情嵌合体胚胎移植后可能存在流产、死产、胎儿畸形、存活子代染色体不平衡、染色体嵌合的风险［11］，同时告知可替代的治疗方案，如进行新的PGT-A周期来避免移植嵌合体胚胎的潜在风险［12］。当患者和医师充分沟通后决定移植嵌合体胚胎时，综合考虑嵌合比例、嵌合类型和胚胎级别，决定胚胎移植的优先顺序［10］，移植后建议通过产前诊断进行染色体检查（比如羊水穿刺），若出现致病或疑似致病的染色体非整倍体，有孕中期引产风险。 

2.2   基因组重组等因素导致连锁分析不准确带来的误诊风险    在基因组上，一般相隔1Mb存在1%的重组概率。因此，进行胚胎单基因疾病致病基因携带状态或染色体微重复微缺失检测时，在致病位点或染色体易位断裂点上下游1Mb区间内寻找连锁位点构建单体型，以降低基因组重组导致的误诊风险。当检测的变异位点处于较长基因上、高度重复序列或重组热点区域，需要谨慎选择构建单体型的关键位点，降低因为重组或双重组导致的误诊风险［13］。

    在胚胎中进行单基因遗传病致病基因检测容易因为等位基因脱扣出现误诊，在突变位点上下游的关键位点构建单体型，再通过家系连锁分析来检测突变位点的携带状态是目前常用的策略，因此提供准确的亲缘关系是正确诊断的前提。若隐瞒通过抱养、再婚、供精或赠卵助孕生育子女等非生物学父母的亲缘关系或错误亲缘关系，可能出现误诊或无法诊断的风险。

3   胚胎活检风险

    相比常规辅助生殖技术（ART）流程，PGT胚胎活检带来的风险包括对胚胎发育潜能的损伤、激光打孔或者切割时光热效应［14］及子代长期风险等，如PGT妊娠可能增加孕期子痫前期、前置胎盘风险［15］及儿童围产期死亡率［16］。有研究发现，虽然PGT妊娠较自然妊娠的前置胎盘率、剖宫产率、早产率显著增加，但与IVF/ICSI妊娠风险相当［17］。2023年一项研究比较了同时期通过PGT单胎妊娠出生子代（n=390）、IVF/ICSI单胎妊娠出生子代（n=61 060）以及自然单胎妊娠出生子代（n=42 034）之间的妊娠结局，结果发现三组间围产期结局、早期儿童健康状况及母体结局无显著差异［18］。此外还包括活检本身对胚胎遗传物质的损伤。近期研究发现，囊胚活检可以改变细胞核结构、导致核芽生（nuclear budding），进而引起非整倍体发生［19］。胚胎活检可分为极体活检、卵裂期卵裂球活检和囊胚期滋养外胚层细胞活检。

    极体活检是对卵母细胞第一次减数分裂产生的第一极体或第二次减数分裂产生的第二极体进行活检。极体是卵母细胞减数分裂过程中排出的产物，相比卵裂球活检和滋养层细胞活检对胚胎的发育潜能影响较小，但不管后续是否能发育成可移植胚胎或囊胚，所有的卵母细胞或受精卵都需要进行极体活检，因此极体活检需要耗费更多的时间和精力，且极体仅可以间接反应母源遗传物质，在母源遗传性疾病、生殖腺嵌合［20］、线粒体遗传病等PGT应用方面具有优势，但不能代表胚胎的遗传物质，因此目前应用逐渐减少。

    卵裂球活检和滋养层细胞活检是常用的胚胎活检时机［21］。卵裂球活检是在受精后第3天，当胚胎发育至6细胞期至致密期前胚胎阶段时，吸取1～2个卵裂球进行遗传学检测。欧洲人类生殖和胚胎学会（European Society of Human Reproduction and Embryology，ESHRE）推荐仅活检1个卵裂球［5］，但有扩增失败风险，导致无法做出遗传学诊断，而活检2个细胞存在降低囊胚发育潜能的风险［22］。与极体活检相比，卵裂球活检的胚胎是第3天的优质胚胎，可以减少活检样本数量，且卵裂球直接代表胚胎的遗传物质，可以同时诊断母源或父源的染色体异常或单基因疾病。对于嵌合体胚胎，卵裂阶段单个卵裂球的检测并不能完全代表整个胚胎的遗传信息，导致漏诊和异常胚胎的移植。 

    囊胚期滋养外胚层细胞活检是在受精后第5～7天，胚胎发育至囊胚阶段时，囊胚内细胞团清晰可见时，取一定数量的滋养层细胞用于遗传学检测。囊胚阶段胚胎细胞数量显著增加，推荐活检的滋养层细胞数为5～10个［5］，能够提供更多的细胞用于遗传学检测 ，从而降低ADO，提高PGT结果的准确性［23］。滋养层细胞将来发育成胎盘，降低了活检影响胚胎发育潜能的风险。一项多中心、前瞻性、盲法、非选择性研究通过对比滋养外胚层活检组和同年龄段未活检对照组的囊胚植入率，发现两组间植入率无差异（47.9% vs. 45.8%），提示滋养细胞外胚层活检对囊胚植入潜能无不良影响［24］。目前，越来越多的PGT采用囊胚期滋养层细胞活检方式，ESHRE针对212个中心、来自2010年至2022年的数据显示，约84.2%的活检为囊胚期活检［11］。但滋养层细胞活检需要胚胎发育到囊胚阶段，囊胚培养过程中，存在没有可供活检的囊胚形成而取消PGT的风险；由于诊断需要时间，囊胚滋养外胚层细胞活检进行PGT需要将全部囊胚冷冻，待诊断结果出具后，需要下次对诊断正常的囊胚行解冻移植。冻融囊胚同样存在复苏失败而导致无胚胎移植的风险；滋养层细胞活检同样存在由于采样偏差而导致与内细胞团遗传学检测结果不一致、嵌合体胚胎移植的风险。

    除了上述3种临床应用的活检样本方法，近年来有学者尝试从囊胚腔液［25］或胚胎培养基中提取游离 DNA进行遗传学检测［26］，相对而言，这些活检样本较易获得、是一种创伤较小或非侵入性的方法。但能提取的DNA数量和质量较差，且来源不明［27］，其中可能含有胚胎代谢产物或细胞碎片，不能完全代表胚胎的遗传物质，因此存在误诊或损失可移植胚胎的风险，相关问题尚需要进一步研究。

4   技术滥用和伦理风险

     实施PGT助孕前，进行专业且充分的遗传咨询非常必要。由具有遗传咨询资质的专业医师根据患者临床表现、专科诊断、基因检测结果、家族史等，判断是否符合PGT适应证和具备PGT助孕条件。对于致病基因未明、子代遗传风险较小的疾病（如超雄、超雌综合征患者配子染色体异常比例较小），不建议使用PGT助孕。根据国家法律法规，严格禁止使用PGT进行非疾病性状的选择，在胚胎诊断报告中需隐藏与性别相关的信息。同时，告知可选择的治疗方案以及相应的利弊风险，如PGT相关的无可移植胚胎、生殖腺嵌合、胚胎嵌合和产前诊断相关的孕中期引产等风险，由患者夫妇充分知情后自愿做出决定。

    PGT技术面临局限性和挑战，如多原核细胞、细胞分裂异常、单亲二倍体或部分单亲二倍体的胚胎，不适用于基因组上高度重复序列区域，例如近着丝粒、端粒、异染色质等区域的异常情况。在线粒体疾病方面，由于线粒体DNA（mitochondrial DNA，mtDNA） 的阈值效应、遗传瓶颈等遗传学特征，导致无法确定PGT用于预防线粒体遗传病的安全阈值［28］，PGT在线粒体遗传病子代传递阻断的应用方面受到限制。

5   结语

     随着胚胎活检技术和遗传学检测技术的发展，目前国内外越来越多的生殖医学中心已开展PGT技术，帮助患者生育健康子代，预防出生缺陷。但任何技术都存在一定的检测范围和局限性，尚需关注有关PGT活检对胚胎和子代长期发育的影响、遗传学检测的局限性存在的风险等。因此，在使用PGT技术的同时、必须重视PGT的相关风险，在PGT流程的不同环节制定风险预防措施［29-30］，做好充分的遗传咨询，从而更好的服务于患者。(参考文献略）