一、限制与修饰（Restriction and modification）
1．限制与修饰现象
早在 50 年代初，有许多学者发现了限制与修饰现象，当时称作寄主控制的专一性（host controlled specificity）。 l 噬菌体表现的现象便具有代表性和普遍性，其在不同宿主中的转染频率可说明这一问题（表 2-1）。 l 在感染某一宿主后，再去感染其它宿主时会受到限制。
E.coli 菌株
λ噬菌体感染率
lK
lB
lC
E.coli K
1
10-4
10-4
E.coli B
10-4
1
10-4
E.coli C
1
1
1
说明 K 和 B 菌株中存在一种限制系统，可排除外来的 DNA 。 10-4 的存活率是由宿主修饰系统作用的结果，此时限制系统还未起作用。而在 C 菌株不能限制来自 K 和 B 菌株的 DNA 。限制作用实际就是限制酶降解外源 DNA ，维护宿主遗传稳定的保护机制。甲基化是常见的修饰作用，可使腺嘌呤 A 成为 N6 甲基-腺膘呤，胞嘧啶 C 成为 5' 甲基胞嘧啶。通过甲基化作用达到识别自身遗传物质和外来遗传物质的目的。
2．限制酶的发现
在 20 世纪 60 年代，人们就注意到 DNA 在感染宿主后会被降解的现象，从而提出限制性切酶和限制酶的概念。 1968 年，首次从 E.coli K 中分离到限制酶，它有特定的识别位点但没有特定的切割位点，其中切割位点离识别位点达 1000bp 以上。
1970 年，美国约翰·霍布金斯大学的 H. Smith 于偶然中发现，流感嗜血杆菌 （Haemophilus influenzae）能迅速降解外源的噬菌体 DNA ，其细胞提取液可降解 E.coli DNA ，但不能降解自身 DNA ，从而找到 HindⅡ 限制性内切酶。 HindⅡ 限制性内切酶位点和切割位点如下：
5 '… GTPy ↓ PuAC … 3 '
3 '… CAPu ↑ PyTG … 5 '
从此以后，发现的限制酶越来越多，并且许多已经在实践中得到应用。 EcoRⅠ 是应用最广泛的限制性内切酶，酶切位点和切割位点如下：
5' G↓AATTC 3'
3' CTTAA↑G 5'
限制性内切酶的命名遵循一定的原则，主要依据来源来定，涉及宿主的种名、菌株号或生物型。命名时，依次取宿主属名第一字母，种名头两个字母，菌株号，然后再加上序号（罗马字）。如 HindⅢ 限制性内切酶， Hin 指来源于流感嗜血杆菌， d 表示来自菌株 Rd ， Ⅲ 表示序号。以前在限制性内切酶和修饰酶前加 R 或 M ，且菌株号和序号小写。但现在限制性内切酶名称中的 R 省略不写。
1986 年下半年发现 615 种限制酶和 98 种甲基化酶； 1998 年发现 10000 种细菌或古细菌中存在 3000 种酶，且酶有 200 多种特异性。到 2005 年 1 月，共发现 4342 种限制酶和甲基化酶，其中限制酶有 3681 种，包括 Ⅰ 型、 Ⅱ 型、 Ⅲ 型限制酶各有 59 、3612 、10 种，甲基化指导的限制酶有 3 种，商业化的限制酶有 588 种，在 Ⅱ 型限制酶中共有 221 种特异性。
3．限制与修饰系统的种类
根据酶的亚单位组成、识别序列的种类和是否需要辅助因子，限制与修饰系统至少可分为四类。表 2-2 是各种限制与修饰系统的比较。
Ⅱ 型（type Ⅱ）限制与修饰系统所占的比例最大，达 93% 。 Ⅱ 型酶相对来说最简单，它们识别回文对称序列，在回文序列内部或附近切割 DNA ，产生带 3'- 羟基和 5'- 磷酸基团的 DNA 产物，需 Mg2+ 的存在才能发挥活性，相应的修饰酶只需 SAM 。识别序列主要为 4-6bp ，或更长且呈二重对称的特殊序列，但有少数酶识别更长的序列或简并序列，切割位置因酶而异，有些是隔开的。
Ⅱs 型（type Ⅱs）限制与修饰系统，占 5% ，与 Ⅱ 型具有相似的辅因子要求，但识别位点是非对称，也是非间断的，长度为 4-7bp ，切割位点可能在识别位点一侧的 20bp 范围内。
Ⅱ 型限制酶一般是同源二聚体（homodimer），由两个彼此按相反方向结合在一起的相同亚单位组成，每个亚单位作用在 DNA 链的两个互补位点上。修饰酶是单体，修饰作用一般由两个甲基转移酶来完成，分别作用于其中一条链，但甲基化的碱基在两条链上是不同的。
在 Ⅱ 型限制酶中还有一类特殊的类型，该酶只切割双链 DNA 中的一条链，造成一个切口，这类限制酶也称切口酶 （nicking enzyme），如 N.Bst NBI 。
Ⅰ 型（type Ⅰ）限制与修饰系统的种类很少，只占 1% ，如 EcoK 和 EcoB 。其限制酶和甲基化酶 （即 R 亚基和 M 亚基） 各作为一个亚基存在于酶分子中，另外还有负责识别 DNA 序列的 S 亚基，分别由 hsdR 、hsdM 和 hsdS 基因编码，属于同一操纵子（转录单位）。 EcoK 编码基因的结构为 R2M2S 。 EcoB 编码基因的结构为 R2M4S2 。
EcoB 酶的识别位点如下，其中两条链中的 A 为甲基化位点， N 表示任意碱基。
TGA*（N）8TGCT
EcoK 酶的识别位点如下，其中两条链中的 A 为可能的甲基化位点。
AA°C（N）6GTGC
但是 EcoB 酶和 EcoK 酶的切割位点在识别位点 1000bp 以外，且无特异性。
Ⅲ 型（type Ⅲ）限制与修饰系统的种类更少，所占比例不到 1% ，如 EcoP1 和 EcoP15 。它们的识别位点分别是 AGACC 和 CAGCAG ，切割位点则在下游 24-26bp 处。
在基因操作中，一般所说的限制酶或修饰酶，除非特指，均指 Ⅱ 型系统中的种类。
表2-2：各种限制与修饰系统的比较
Ⅱ
Ⅰ
Ⅲ
酶分子
内切酶与甲基化酶
分子不在一起
三亚基双功能酶
二亚基双功能酶
识别位点
4-6bp, 大多数为回文对称结构
二分非对称
5-7bp 非对称
切割位点
在识别位点中或靠近识别位点
无特异性，至少在识别位点外 1000bp
在识别位点下游 24-26bp
限制反应与甲基化反应
分开的反应
互斥
同时竞争
限制作用是否需用 ATP
No
Yes
Yes
二、限制酶识别的序列
1．限制酶识别序列的长度
限制酶识别序列的长度一般为 4-8 个碱基，最常见的为 6 个碱基（表2-3）。当识别序列为 4 个和 6 个碱基时，它们可识别的序列在完全随机的情况下，平均每 256 个和 4096 个碱基中会出现一个识别位点（44=256，46=4096）。以下是几个有代表性的种类，箭头指切割位置。
4 个碱基识别位点：Sau3AⅠ ↓GATC
5 个碱基识别位点：EcoRⅡ ↓CCWGG
NciⅠ CC↓SGG
6 个碱基识别位点：EcoRⅠ G↓AATTC
HindⅢ A↓AGCTT
7 个碱基识别位点：BbvCⅠ CC↓TCAGC
PpuMⅠ RG↓GWCCY
8 个碱基识别位点：NotⅠ GC↓GGCCGC
SfiⅠ GGCCNNNN↓NGGCC
以上序列中部分字母代表的碱基如下。
R=A 或 G Y=C 或 T M=A 或 C
K=G 或 T S=C 或 G W=A 或 T
H=A 或 C 或 T B=C 或 G 或 T V=A 或 C 或 G
D=A 或 G 或 T N=A 或 C 或 G 或 T
2．限制酶识别序列的结构
限制酶识别的序列大多数为回文对称结构，切割位点在 DNA 两条链相对称的位置。 EcoRⅠ 和 HindⅢ 的识别序列和切割位置如下。
EcoRⅠ G↓AATTC HindⅢ A↓AGCTT
CTTAA↑G TTCGA↑A
有一些限制酶的识别序列不是对称的，如 AccBSⅠ[CCGCTC（-3/-3）] 和 BssSⅠ[CTCGTG（-5/-1）]。识别序列后面括号内的数字表示在两条链上的切割位置。
AccBSⅠ CCG↓CTC BssSⅠ C↓TCGTG
GGC↑GAG GAGCA↑C
有一些限制酶可识别多种序列，如 AccⅠ 识别的序列是 GT↓MKAC ，也就是说可识别 4 种序列，其中两种是对称的，另两种是非对称的。 HindⅡ 识别的序列是 GTY↓RAC 。
有一些限制酶识别的序列呈间断对称，对称序列之间含有若干个任意碱基。如 AlwNⅠ 和 DdeⅠ ，它们的识别序列如下。
AlwNⅠ CAGNNNC↓TG DdeⅠ C↓TNAG
GT↑CNNNGAC GANT↑C
3．限制酶切割的位置
限制酶对 DNA 的切割位置大多数在内部，但也有在外部的。在外部的，又有两端、两侧和单侧之别。切点在两端的有 Sau3AⅠ（↓GATC）、NlaⅢ（CATG↓）和 EcoRⅡ（↓CCWGG） 等；在两侧的有 BcgⅠ[（10/12）CGA（N）6TGC（12/10）]和 TspRⅠ（CASTGNN↓）， BcgⅠ 酶的切割特性与其它酶不同，它们在识别位点的两端各切开一个断点，而不是只产生一个断点。切点在识别位点外侧的还有 BbvⅠ[GCAGC（8/12）] 和 BspMⅠ[ACCTGC（4/8）] 等。
BcgⅠ ↓10（N）CGA（N）6TGC（N）12↓ TspRⅠ NNCAC（G）TGNN↓
↑12（N）CGA（N）6ACG（N）10↑ ↑NNGTG（C）ACNN
三、限制酶产生的末端
1．限制酶产生匹配粘端（matched ends）
识别位点为回文对称结构的序列经限制酶切割后，产生的末端为匹配粘端，亦即粘性末端（cohesive end），这样形成的两个末端是相同的，也是互补的。若在对称轴 5' 侧切割底物， DNA 双链交错断开产生 5' 突出粘性末端，如 EcoRⅠ ；若在 3'-侧切割，则产生 3' 突出粘性末端，如 KpnⅠ 。
NNG↓AATTCNN EcoRⅠ NNG AATTCNN
NNCTTAA↑GNN NNCTTAA GNN
2．限制酶产生平末端（Blunt end）
在回文对称轴上同时切割 DNA 的两条链，则产生平末端，如 HaeⅢ（GG↓CC）和 EcoRV（GAT↓ATC）。产生平末端的 DNA 可任意连接，但连接效率较粘性末端低。
3．限制酶产生非对称突出端
许多限制酶切割 DNA 产生非对称突出端。当识别序列为非对称序列时，切割的 DNA 产物的末端是不同的，如 BbvCⅠ ，它的识别切割位点如下。
CC↓TCAGC
GGAGT↑CG
有些限制酶识别简并序列，其识别的序列中有几种是非对称的。如 AccⅠ ，它的识别切割位点如下，其中 GTAGAC 和 GTCTAC 为非对称。
GT↓AT/CGAC
CATA/GC↑TG
有些限制酶识别间隔序列，间隔区域的序列是任意的，如 DraⅢ 和 EarⅠ ，它们的识别切割位点分别是 CAC↑NNN↓GTG 和 CTCTTC （1/4）。
4．同裂酶（isoschizomer）
识别相同序列的限制酶称同裂酶，但它们的切割位点可能不同。具体可分为以下几种情况。
① 同序同切酶 这些酶识别序列和切割位置都相同，如 HindⅡ 与 HincⅡ 识别切割位点为 GTY↓RAC ， HpaⅡ 与 HapⅡ 识别切割位点为 C↓CGG ， MobⅠ 与 Sau3AⅠ 识别切割位点为 ↓GATC 。
② 同序异切酶 KpnⅠ 和 Acc65Ⅰ 识别的序列是相同的，但它们的切割位点不同，分别为 GGTAC↓C 和 G↓GTACC 。另外， Asp718Ⅰ 识别和切割位点为 G↓GTACC 。
③“同功多位”许多识别简并序列的限制酶包含了另一种限制酶的功能。如 EcoRⅠ 识别和切割位点为 G↓AATTC ， ApoⅠ 识别和切割位点为 R↓AATTY ，后者可识别前者的序列。另外， HpaⅠ 和 HincⅡ 的识别位点也有交叉，它们的识别和切割位点分别为 GTT↓AAC 和 HincⅡ 。
④ 其它有些限制酶识别的序列有交叉，如在 pUC 系列质粒的多克隆位点中有一个 SalⅠ 位点（识别切割位点为 G↓TCGAC），该位点也可被 AccⅠ（识别切割位点为 GT↓MKAC）和 HincⅡ（识别切割位点为 GTY↓RAC）切割。
5．同尾酶
许多不同的限制酶切割 DNA 产生的末端是相同的，且是对称的，即它们可产生相同的粘性突出末端。这些酶统称为同尾酶。这些酶切割 DNA 得到的产物可进行粘端连接。以下几种酶产生的末端是相同的。通过表 4-3 很容易判断哪些酶可产生相同的 DNA 末端。
·EcoRⅠ G↓AATCC MfeⅠ C↓AATTC ApoⅠ R↓AATTY
·SpeⅠ A↓CTAGT NheⅠ G↓CTAGC XbaⅠ T↓CTAGA
·BamHⅠ G↓GATCC Sau3AⅠ ↓GATC StyⅠ C↓CWWGG
·ClaⅠ AT↓CGAT AccⅠ GT↓MKAC （pUC19）
6．识别特殊系列的 I-prefix 和 pI-prefix 系列酶
有些线粒体、叶绿体、核 DNA 、T 偶数噬菌体含有一些编码内切酶的内含子，有些 intein （protein splicing element） 也有内切酶的活性，这两类内切核酸酶称为 I-prefix 和 pI-prefix 系列内切酶，它们识别的序列很长。 I-prefix 是由在 RNA 水平上剪切和编码的， pI-prefix 在蛋白质水平上剪切的产物。这类内切酶也称为 homing endonuclease ，目前商业化的种类有 6 种。从因特网上可以找到 Intein 的数据库 Inbase（Intein Database），该网站由 New England BioLabs 公司维护（http://www.neb.com）。
I-CeuI 酶是衣滴虫（Chlamydomonas eugametos）叶绿体大 rRNA 基因的内含子编码的产物，识别位点为 26bp ，识别的核心部位为 -12 至 +7 位置的 19bp 。反应温度为 37℃ ，识别位点如下，方框内为核心识别序列。
TAACTATAACGGTC↑CTAA↓GGCA
四、DNA末端长度对限制酶切割的影响
限制酶切割 DNA 时对识别序列两端的非识别序列有长度的要求，也就是说在识别序列两端必须有一定数量的核苷酸，否则限制酶将难以发挥切割活性。
用 20 单位（Units）限制酶切割 1mg 标记的寡核苷酸做测试时，发现不同的酶对识别序列两端的长度有不同的要求（表 2-4）。相对来说， EcoRⅠ 对两端的序列长度要求较小，在识别序列外侧有一个碱基对时在 2 小时的切割活性可达 90% 。而 AccⅠ 和 HindⅢ 对两端的序列长度要求较大。
表2-4：靠近DNA片段末端的切割效率%（用寡核苷酸检测）
限制酶 待测的寡核苷酸序列待测的寡核苷酸序列
2hr20hr
AccⅠCCGGTCGACCGG00
HindⅢCAAGCTTG
CCAAGCTTGG
CCCAAGCTTGGG
0
0
10
0
0
75
EcoRⅠGGAATTCC>90>90
PstⅠ GCTGCAGC
TGCACTGCAGTGCA
AACTGCAG（N）14
CTGCAG（N）20
0
10
>90
0
0
10
>90
0
用 DNA 片段（线性载体）检测末端长度对切割的影响时，同样发现识别序列的末端长度对酶切效率有明显影响，不同的酶对末端长度的要求是不同。
在设计 PCR 引物时，如果要在末端引入一个酶切位点，为保证能够顺利切割扩增的 PCR 产物，应在设计的引物末端加上能够满足要求的碱基数目。另外，了解末端长度对切割的影响还可帮助在双酶切多克隆位点时选择酶切秩序。
五、位点偏爱（Site preference）
某些限制酶对同一介质中的有些位点表现出偏爱性切割，即对不同位置的同一个识别序列表现出不同的切割效率的现象称作位点偏爱。
某些噬菌体 DNA 中的某些相同的酶切位点对酶的敏感性是不同。λ 噬菌体 DNA 为 48502bp ，含 12bp 粘端。 EcoRⅠ 酶切割 l 噬菌体中的 5 个位点时并不是随机的，靠近右端的位点比分子中间的位点切割快 10 倍； EcoRⅠ 对腺病毒 2（adenvirus-2）DNA 不同位置切点的切割速率也不同。 EcoRⅠ 和 HindⅢ 在 l 噬菌体 DNA 中的切割速率分别有 10 倍和 14 倍的差异。 l 噬菌体 DNA 有 4 个 SacⅡ 位点，三个在中央，一个在右臂，对中央三个位点的酶切速度快 50 倍。在 φX174 噬菌体 （单链环状， 5386bp ， DNA 复制时可以双链形式存在） DNA 中发现 HgaⅠ 切割某些位点比其它的快。在腺病毒 2 中， CTCGAG 位点对 PaeR7Ⅰ 完全抵抗，但同裂酶 XhoⅠ 却很易切割，原因是 5' 末端有一个 CT 二核苷酸，与甲基化完全无关。
造成上述现象的原因有以下几种情况。 NarⅠ ， NaeⅠ 和 SacⅡ 三种酶属于在切割 DNA 之前需要同时与两个识别位点作用的一类酶。 BspMⅠ、EcoRⅡ 和 HpaⅡ 则属另一种情况，它们对要求作用的 DNA 序列上有两个明显不同的结合位点，其中一个是为 DNA 切割激活另一个的变构位点（allosteric）。这两序列可由顺式（cis）方式提供，即相互靠近或形成环（loop）；或由反式（trans）方式提供，其变构位点由含识别序列的寡核苷酸提供。
六、酶切反应条件
1．缓冲液
常规缓冲液一般包括提供稳定 pH 值的缓冲剂、 Mg++ 、 DTT（二硫苏糖醇）以及 BSA（小牛血请白蛋白）。
pH 经常为 7.0-7.9（在 25℃ 时），用 Tris-HCl 或乙酸调节； Mg++ 作为酶的活性中心，由 MgCl2 和 MgAc 提供； 浓度常为 10mM ；DTT 浓度常为 1mM 。有时缓冲液中还要加入 100mg/ml BSA ，但只是少数反应需要。不同的酶对离子强度的要求差异很大，并依次将限制酶缓冲液按离子强度的差异分为高、中、低三种类型，离子强度以 NaCl 来满足，浓度分别为 100mM 、50mM 和 0mM 。
要对 DNA 进行双酶切时，如何选择缓冲液是相当重要的。一方面可选用都合适的缓冲液或通用缓冲液；若找不到共用的缓冲液则先用低浓度的，再加适量 NaCl 和第二种酶；或先用低盐缓冲液再用高盐缓冲液（DNA 可纯化或不纯化）。
2．反应温度
反应温度大多数为 37℃ ，一部分为 50-65℃ ，少数 25-30℃ 。高温作用酶在 37℃ 下的活性会下降，多数仅为最适条件下的 10-50% 。如 Taq 限制酶（正常反应温度为 65℃），在 37℃ 只有在 65℃ 活性的 10% ； ApoⅠ（正常反应温度为 50℃）， 37℃ 只有在 50℃ 时活性的 50% 。销售商在产品说明中都会标明最佳反应温度。
3．反应时间
反应时间通常为 1 小时或更多，许多酶延长反应时间可减少酶的用量。 EcoRⅠ 若反应 16 小时，所需酶量为正常酶切时间的 1/8 ，即若反应时间为 16 小时，则所用酶量为只切 1 小时的 1/8 。其它一些酶也有类似情况，如HindⅢ为1/8；KpnⅠ为1/4；BamHⅠ为1/2。
4．终止酶切的方法
EDTA 可鏊合镁离子，从而可终止酶切反应，终止浓度为 10mM ；加热是常用的方法，对于最佳反应温度为 37℃ 的酶，在 65℃ 或 80℃ 处理 20 分钟可使酶活性大部分丧失。但是对于在 80℃ 作用 20 分钟也有不失活的酶，如最佳反应温度为 37℃ 的酶 Bg1Ⅱ、HpaⅠ 和 PvuⅡ ， 65℃ 酶 Tth111Ⅰ 和 TspRⅠ ，以及 50℃ 酶 Bc1Ⅰ ，可用苯酚抽提去除蛋白，或用试剂盒纯化 DNA 。
七、星星活性（star activity）
在极端非标准条件下，限制酶能切割与识别序列相似的序列，这个改变的特殊性称星星活性。实际上星星活性是限制性内切酶的一般性质，任何一种限制酶在极端非标准条件下都能切割非典型位点，如 ApoⅠ、AseⅠ、BamHⅠ、BssH11、EcoRⅠ、EcoRV、HindⅢ、HinfⅠ、KpnⅠ、PstⅠ、PvuⅡ、SalⅠ、ScaⅠ、TaqⅠ 和 XmnⅠ 等酶皆可表现出星星活性。星星活性在绝大多数情况下是可控制的。
限制酶的特异性变化方式与酶的种类和所用的条件有关，最普遍的活性变化来自 1 个碱基的变化、识别位点外层碱基的随意性，以及单链缺口。
引起星星活性的因素有甘油浓度高（>5%），酶过量（>100U/ml），离子强度低（<25mM）， pH 值过高（>8.0），或是加了有机溶剂如 PMSD （二甲基亚砜）、乙醇、乙二醇、二甲基乙酰胺（dimethylacetamide）、二甲基甲酰胺（dimethbylformamide）、 sulphalane 等等，或是用其它二价阳离子如 Mn++ 、Cu++、Co++ 或 Zn++ 代替了 Mg++ 。但不同的酶对上述条件的敏感性不一样，如 PstⅠ 比 EcoRⅠ 对高 pH 更敏感，但后者对甘油浓度更敏感。
抑制星星活性的措施有许多，如减少酶的用量（可避免过份酶切），减少甘油浓度，保证反应体系中无有机溶剂或乙醇，提高离子强度到 100～150mM （如果不会抑制酶的活性的话），降低反应 pH 至 pH7.0 ，以及保证使用 Mg++ 作为二价阳离子。
八、单链 DNA 的切割
部分切割双链 DNA 的酶也可消化其单链，但是切割效率不同。 HinPⅡ、HhaⅠ、MnlⅠ 切割单链 DNA 的效率是切割双链的 50% ， HaeⅢ 切割单链 DNA 的效率是切割双链的 10% ， BstNⅠ、DdeⅠ、HgaⅠ、HinfⅠ、TaqⅠ 切割单链 DNA 的速度比切割双链慢 100 倍。还有一些酶不切割单链 DNA ，如 AluⅠ、BbvⅠ、DpnⅠ、FnuDⅡ、FokⅠ、HpaⅡ、HphⅠ、MobⅠ、MobⅡ、MspⅠ、Sau3AⅠ、SfaNⅠ 等等。
有些限制酶只切割双链 DNA 中的一条链，产生单链缺口，即切口酶（nicking enzyme），如 N.BstNBⅠ。这类酶在命名时前面要加一个 N 。目前已经商品化的这类酶共有 7 种。 N.BstNBⅠ 的识别序列和切割位置如下。
5′... G A G T C N N N N N ...3′
3′... C T C A G N N N N N ...5′
九、酶切位点的引入
在酶切水平上，通过酶切和连接可产生新的酶切位点。
（1）将产生的 5' 突出端补平后，再连接可产生新的酶切位点。 EcoRⅠ 的识别位点是 GAATTC ，先用它来切片段，将 5' 突出端补平后，再连接可产生 XmaⅠ（GAANNNNTTC）和 AceⅠ（ATTAAT）酶切位点，而 EcoRⅠ 的酶切位点消失。
……G AATTC…… 补平 ….GAATT AATTC…. 连接 ….GAATTAATTC…
……CTTAA G…… ….CTTAA TTAAG…. ….CTTAATTAAG…
对 HindⅢ 位点（AAGCTT）来说，经酶切和连接可产生 AluⅠ 和 NheⅠ 酶切位点，同时 HindⅢ 位点消失。
（2）同尾末端的连接。不同的同尾酶切割 DNA 产生的末端再相互连接时，可产生新的酶切位点，同时原来的酶切位点却消失。例如 BamHⅠ（G↓AATCC）+ BclⅠ（T↓GATCA）→ AlwⅠ（GGATC 4/5），又如 XbaⅠ（T↓CTAGA）+AvrⅡ，或 NheⅠ 或 SpeⅠ 或 StyⅠ（CCTAGG）→ BfaⅠ（C↓TAG） 也产生了新的酶切位点。
（3）平端连接。平末端的限制酶切割的DNA在连接后也可产生新的酶切位点，例如 PvuⅡ（CAGCTG）+ EcoRV（GATATC）→ MobⅠ（GATC）。
十、影响酶活性的因素
影响酶切活性的因素有许多，概略的说可分为外因和内因。外因是可预见和控制的，如反应条件、底物的纯度（是否有杂质、是否有盐酚的污染）、何时加酶、操作是否恰当、反应体积的选择以及反应时间的长短等等。内因包括位点偏爱性、甲基化底物、底物的构象。构象的影响主要指切割线性 DNA 和超螺旋 DNA 时的活性，如与切割 lDNA 相比， EcoRⅠ、PstⅠ、SalⅠ 需要至少 2.5-10 倍的酶来切割 pBR322 的超螺旋 DNA 。 PaeRTⅠ 与 XhoⅠ 切割相同的序列（C↓TCGAG），但如果 5' 端为 CT 则 PaeRTⅠ 不能切割。
十一、酶切位点在基因组中分布的不均一性
在基因组中碱基对的排列是非均匀的，因此尽管有的酶切序列中 GC 含量相同，但在基因组中出现的机率还是不一样。如在 E.coli 中， AsoⅠ（GGCGCGCC）切点平均 20kb 中出现一个，而 NotⅠ（GCGGCCGC） 切点平均 200kb 中出现一个（常利用它出现的机会少来构建图谱）， EcoRⅠ 和 HindⅢ 切点平均 5kb 中出现一个，而 SpeⅠ（ACTAGT） 切点平均 60kb 中出现一个。
