基因工程（一）

重点知识归纳及讲解

 

（一）基因工程的概念

基因工程是指按照人们的愿望，进行严格的设计，并通过体外DNA重组和转基因等技术，赋予生物以新的遗传特性，从而创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。由于基因工程是在DNA分子水平上进行设计和施工的，因此又叫做DNA重组技术。

（二）DNA重组技术的基本工具

1、限制性核酸内切酶——“分子手术刀”

切割DNA的工具是限制性核酸内切酶，又称限制酶。这类酶主要是从原核生物中分离纯化出来的。

限制酶能够识别双链DNA分子的某种特定核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开。大多数限制酶的识别序列由6个核苷酸组成，也有少数限制酶的识别序列由4、5或8个核苷酸组成。

思考：限制酶存在于原核生物中的作用是什么？

原核生物容易受到自然界外源DNA的入侵，但是，生物在长期的进化过程中形成了一套完善的防御机制，以防止外来病原物的侵害。限制酶就是细菌的一种防御性工具，当外源DNA侵入时，会利用限制酶将外源DNA切割掉，以保证自身的安全。所以，限制酶在原核生物中主要起到切割外源DNA，使之失效，从而达到保护自身的目的。

2、DNA连接酶——“分子缝合针”

能够将两条DNA链连接起来的酶，称之为DNA连接酶。

（1）E·coli DNA连接酶：

它是从大肠杆菌中分离得到的，它只能将双链DNA片段互补的黏性末端之间连接起来，不能将双链DNA片段平末端之间进行连接。

（2）T4 DNA连接酶：

它是从T4噬菌体中分离出来的。它对黏性末端和平末端都可以进行“缝合”，但连接平末端的效率比较低。

思考：DNA连接酶与DNA聚合酶是一回事吗？

不是一回事。DNA聚合酶只能将单个核苷酸加到已有的核酸片段的3′末端的羟基上，形成磷酸二酯键；而DNA连接酶是在两个DNA片段之间形成磷酸二酯键，不是在单个核苷酸与DNA片段之间形成磷酸二酯键。DNA聚合酶是以一条DNA链为模板，将单个核苷酸通过磷酸二酯键形成一条与模板链互补的DNA链；而DNA连接酶是将DNA双链上的两个缺口同时连接起来，因此DNA连接酶不需要模板。二者虽然都是由蛋白质构成的酶，但组成和性质各不相同。

3、基因进入受体细胞的载体——“分子运输车”

充当“分子运输车”应具备的条件：能自我复制；有一个或多个切割位点；有标记基因位点；对受体细胞无害；载体DNA分子大小适合，便于操作。

在基因工程中通常利用质粒作为载体，将基因送入细胞中。此外，还有λ噬菌体的衍生物、动植物病毒等作为载体。

（三）基因工程的基本操作程序

1、目的基因的获取

目的基因可以从自然界中已有的物种中分离出来，也可以用人工的方法合成。

（1）从基因文库中获取目的基因：

根据目的基因的有关信息（如基因的核苷酸序列、基因的功能、基因在染色体上的位置、基因的转录产物mRNA、基因的翻译产物蛋白质等特性）来获取目的基因，这是一项比较复杂的工作。

（2）利用PCR技术扩增目的基因：

PCR是一项在生物体外复制特定DNA片段的核酸合成技术，以此可以获取大量的目的基因。

（3）通过DNA合成仪用化学方法直接人工合成。

2、基因表达载体的构建（基因工程的核心）

构建基因表达载体的目的是使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代，同时，使目的基因能够表达和发挥作用。因此，一个基因表达载体的组成，除了目的基因外，还必须有启动子、终止子以及标记基因等。

思考：为什么不将生物的所有DNA直接导入受体细胞？

有人采用总DNA注射法进行遗传转化，即将一个生物中的总DNA提取出来，通过注射或花粉管通道法导入受体植物，没有进行表达载体的构建，这种方法针对性差，完全靠运气，也无法确定什么基因导入了受体植物。此法目前争议颇多，严格来讲不算基因工程。

3、将目的基因导入受体细胞

（1）将目的基因导入植物细胞（农杆菌转化法、基因枪法、花粉管通道法）：

 

 

（2）将目的基因导入动物细胞：

通过卵细胞进行显微注射，将目的基因导入。

（3）将目的基因导入微生物细胞：

①用Ca2+处理细胞，使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态，这种细胞称为感受态细胞。

②将重组表达载体DNA分子溶于缓冲液中与感受态细胞混合，在一定的温度下促进感受态细胞吸收DNA分子，完成转化过程。

4、目的基因的检测与鉴定

（1）分子检测：

①检测转基因生物染色体的DNA上是否插入了目的基因；

②检测目的基因是否转录出了mRNA；

③检测目的基因是否翻译成蛋白质。

（2）个体生物学水平的鉴定：

如一个抗虫目的基因导入植物细胞后，需要做抗虫实验，以确定是否具有抗虫性以及抗虫性的程度。

 

课外拓展

 

作为基因工程使用的载体必需满足的条件

 

1、载体DNA必需有一个或多个限制酶的切割位点，以便目的基因可以插入到载体上去。这些供目的基因插入的限制酶的切点所处的位置，还必须是在质粒本身需要的基因片段之外，这样才不至于因目的基因的插入而失活。

2、载体DNA必需具备自我复制的能力，或整合到受体染色体DNA上随染色体DNA的复制而同步复制。

3、载体DNA必需带有标记基因，以便重组后进行重组子的筛选。

4、载体DNA必需是安全的，不会对受体细胞有害，或不能进入到除受体细胞外的其他生物细胞中去。

5、载体DNA分子大小应适合，以便提取和在体外进行操作，大太就不便操作。

实际上自然存在的质粒DNA分子并不完全具备上述条件，都要进行人工改造后才能用于基因工程操作。

PCR的扩增过程

PCR扩增是获取目的基因的一种非常有用的方法，也是进行分子鉴定和检测的一种很灵敏的方法。PCR的扩增反应过程包括以下几个主要过程。

第一步：将反应体系（包括双链模板、引物、耐高温的DNA聚合酶、四种脱氧核糖核苷酸以及酶促反应所需的离子等）加热至90～95℃，使双链DNA模板两条链之间的氢键打开，变成单链DNA，作为互补链聚合反应的模板。

第二步：将反应体系降温至55～60℃，使两种引物分别与模板DNA链3′端的互补序列互补配对，这个过程称为复性。

第三步：将反应体系升温至70～75℃，在耐高温的DNA聚合酶催化作用下，将与模板互补的单个核苷酸加到引物所提供的3—OH上，使DNA链延伸，产生一条与模板链互补的DNA单链。

上述三步反应完成后，一个DNA分子就变成了两个DNA分子，随着重复次数的增多，DNA分子就以2n的形式增加。PCR的反应过程都是在PCR扩增仪中完成的。

如何从基因文库中找到所需要的基因

从基因文库中找到目的基因是一件比较复杂的事情，要根据目的基因已有的某些信息来进行。下面介绍一种根据基因的部分核苷酸序列找到目的基因的方法。

第一步，通过PCR方法将目的基因已知的部分核苷酸序列扩增出来，进行放射性同位素标记（也可以用别的标记方法进行，如生物素、荧光素等），即用标记了放射性同位素的目的DNA片段作为探针，与扩增出来的DNA杂交。

第二步，将基因文库中的所有菌落转移至硝酸纤维膜上（也可以用其他类型的膜），然后，通过处理溶解消化掉细菌中的蛋白质，并使DNA固定在膜上。

第三步，按Southern杂交的方法进行杂交。

第四步，在X光底片上出现黑斑的菌落，这表明这个菌落中含有所需要的目的基因（若选用别的标记方法，有阳性信号的菌落则含有所需要的目的基因）。

第五步，从该菌落中再提取目的基因。