PCR成为目前开展miRNA表达谱分析的最常用方法。它灵敏快速，操作简单。当然，若想获得稳定可靠的结果，也须花费一番努力。为此，Exiqon公司的专家分享了成功开展miRNA qPCR的五条重要建议，为大家的研究助力。
1. 选择适当数量的重复
使用重复的目的是消除差异引起的噪音。取决于样品的差异程度，它可能需要包含生物学和技术重复。具体需要哪种重复，这取决于实验中引入最大变异的步骤。样品本身需要生物学重复，而RNA提取、RT和PCR步骤需要技术重复。重复的数量取决于变异水平，但绝不能低于三个。如果只用了两个重复，且它们差异显著，那么就很难确定哪个是异常值。
2. 确定最佳的对照
在研究中应当使用阴性和阳性对照。阴性对照能用来显示污染，并确定每个分析的背景水平。使用哪个阴性对照要取决于实验，但一般应包括：
无酶对照：不含酶的RT反应，以检查DNA污染
无模板对照：不含模板的RT或PCR反应，以检查试剂是否存在污染，并显示引物二聚体
mock对照：带有载体RNA（如MS2）的RT对照，以检查提取过程中使用的载体或其他RNA是否会增加背景
实验中也应当使用阳性对照，以检查样品的质量，并进行troubleshooting。阳性对照可以是合成的RNA spike-in。这是cDNA合成反应的对照，也很容易判断样品中是否存在PCR抑制剂。
3. 开展反应的质量控制
为了开展质量控制，应当监控扩增子的熔解温度（Tm）和分析效率。miRCURY LNA? Universal RT microRNA PCR系统中使用SYBR Green检测，这可以产生解离曲线，而不同运行之间特定扩增子的Tm应当相同。因此，Tm可用来验证是否获得了相同的扩增子。解离曲线应当只有一个峰，而不同仪器的Tm可能会有差异，这是因为不同的温度校准。
4. 选择良好的参考基因
选择最佳的参考基因或参考基因组合，这至关重要，它可实现miRNA定量分析的标准化。如果利用含有几百个miRNA的分析板进行筛选，标准化的最佳方法是取所有表达miRNA的平均值。在小型研究中，可使用一个或多个稳定表达的内源对照。这可从筛选研究中选择。如果未开展此类研究，则应当从文献中挑出一些候选参考基因。
5. 选择优秀的数据分析软件
适当的数据分析对您下结论很重要。利用高质量的数据分析软件进行数据分析，如Exiqon GenEx，可获得正确的miRNA图谱。
在Exiqon GenEx中，一个易用的互动助手将指导您导入数据，选择适当的参考基因，标准化及最后的数据分析。
通过简单的几步，Exiqon GenEx就能生成复杂的统计表以及可立即发表的图片，让您清晰地查看结果。
关于miRNA qPCR实验的更多指南，请联系康成生物（Exiqon中国代理商）索取。
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