COVID

本文来源：上海图书馆信使；作者：上海图书馆蒋洁如

新型冠状病毒检测为何会出现假阴性？

当前，新型冠状病毒感染病例进入了集中爆发期，防疫战进入了最为艰难的时刻。在整个防疫治疗的过程中，病例的确诊是至关重要的环节。

但目前，却出现了多个确诊病例在检测多次之后才出现阳性，或者病毒核酸检测为阴性，而实际CT显示为肺部感染新冠病毒症状的情况。

面对全新的冠状病毒，以及频频出现检测“假阴性”的报道，人们不禁猜测，是新冠病毒出现变异了吗？核酸检测真的准确吗？

日前北京大学人民医院呼吸内科主任高占成在接受央视采访时表示：

任何病毒核酸检测的检出率都不可能是百分之百，出现假阴性不可避免。

那么，究竟是哪些因素可能导致核酸检测出现假阴性呢？让小编带着大家一起，探究新型冠状病毒检测方法，找出出现假阴性可能的原因。

• 什么是新型冠状病毒（2019-nCoV）？

在了解检测方法之前，我们先要了解一下检测的对象，知己知彼方方可百战不殆。

新型冠状病毒（2019-nCoV）是一种RNA单链病毒。相对于DNA病毒，它比较不稳定，容易发生变异。

在冠状病毒α、β、γ和δ四个属中，新型冠状病毒属于β属。与中东呼吸综合征相关冠状病毒（MERSr-Cov）、严重急性呼吸综合征相关冠状病毒（SARSr-Cov）一样，它们都会引起严重的呼吸道感染。

但是，新型冠状病毒与SARSr-Cov病毒（约79%相同）和MERSr-Cov病毒(约50%相同)在基因序列上又存在明显区别。

• 我们怎么检测新型冠状病毒？

新型冠状病毒的常规检测方法是荧光RT-PCR(Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction)检测法。RT-PCR检测法是聚合酶链式反应（PCR）的一种广泛应用的变形。

经逆转录酶的作用，将病毒RNA片段逆转录成互补DNA（cDNA），再以cDNA为模板，在DNA聚合酶作用下扩增合成目标片段，经过扩增后的目标片段可以被荧光探针探测到，从而可以特异性地检测出检测标本中存在的痕量病毒RNA。

• RT-PCR核酸检测结果真的准确吗？

从原理上看，准确！

从上一部分的检测原理的角度可知，RT-PCR核酸检测方法能够非常有效地特异性地检测出送检的样本中是否存在新型冠状病毒的RNA序列。

我国国家卫健委提出的针对新型冠状病毒的检测标准，需要对病毒的多个保守目标序列上的两个目标靶点（ORFlab、N）均进行扩增检测，只有当两个都显示阳性了，才能确诊。用多个保守目标序列进行检测，也是为了防止因病毒变异导致的检测结果不准确。

新冠病毒参考基因组 数据来源：NCBI GenBank

• 为什么RT-PCR检测结果会出现假阴性？

如果说肺部CT的影像表征呈现的是一个“犯罪现场”，医务人员提交的标本是移送了包含致病物质的“嫌疑犯”，那么RT-PCR检测就是“审判”凶手是不是新型冠状病毒这个“嫌疑犯”的法官。

继续借用“犯罪现场”的说法，检测手段是一场“审判”的话，审判结果（检测结果）取决于前期侦察（患者筛查），嫌疑人判定（CT检查），嫌疑人抓捕（医生采样），证据提交（样本运送与保存），法官判案（检测系统）等多方面综合的因素。当其中的任何一个环节出了差错，就会导致检测结果的不准确。

RT-PCR核酸检测方法的最大特点是特异性高、灵敏度高，但最大的弱点是易受污染影响。一旦样本质量差，样本收集时间过早或过晚，没有正确地保存、运输和处理样本，就容易造成检测失败。

采样环节

根据国家卫建委的新冠病毒检测标准可知，核酸检测标本主要有上呼吸道标本（咽拭子、鼻拭子等）、下呼吸道标本（痰液、肺泡灌洗液、支气管灌洗液等）和血液标本。由于新冠病毒与普通流感病毒的明显区别在于，病人主要为干咳、无痰，所以目前的普遍采样方式为咽拭子。咽拭子的病毒含量少，再加上取样操作复杂，就容易导致病毒载量过低而无法测出。

保存环节

标本保存的环境条件也十分严格，参照国家卫健委给出的标准即可知。而在疫情期间，在如此大量的待测样本下，必定会存在多数样本超过24小时才得到检测，那么这些样品就需要在-70℃下才能长期保存，这么苛刻的保存条件，如果某些样本没能得到完善的保存也是在情理之中了。

运输环节

标准还规定，采集样本后应尽快送往实验室，如果是长途运输，则需要干冰制冷保藏。这也看出，病毒标本的运输并非易事。

检测环节

避免RNA酶污染也是RT-PCR检测成功的关键之一，使用的全部器皿和耐高压的试剂都必须经高压灭菌处理。操作者全程都应该戴一次性手套和口罩，以防污染。

检测试剂

检测试剂盒的检出率也是影响检测结果的原因之一。根据国家药品监督管理局医疗器械技术审评中心制定的《呼吸道病毒多重核酸检测试剂注册技术审查指导原则（2019年80号）》可知，检测试剂需要保证90%-95%的检出率。也就是说，存在5%-10%的可能性未检出。目前，越来越多的企业参与到病毒检测试剂盒的研发和生产队伍当中，不同生产厂家的检测试剂盒的灵敏度也参差不齐，这也会增加检出假阴性的概率。

综合以上因素

要想成功地完成一次核酸检测，并非易事。从样本采集到后续的检测，均要严格遵照实验条件，任何一个环节出错，都会导致最后结果的失败。而疫情期间，面对如此大量的待测样本，保证每个环节都不出错，难度很大。

• 目前有几家生产核酸检测盒的企业？

目前，已有6家公司的7个新型冠状病毒检测试剂盒获批，其中上海占了3家。一些地方政府为此开辟了绿色通道，加速其他生产企业的试剂盒的获批，同时，国家药监局也在加大力量做好质量把控，为此专门配备了专业审评员，负责24小时给予受评公司问题解答。

此外，中国疾病预防中心病毒病预防控制所还成功研制了新型冠状病毒（2019-nCoV）核酸等温扩增快速检测试剂盒，可在8-15分钟内出结果，极大缩短检测时间，配套等温扩增仪器可自动判读结果。

相信测试技术的提高、试剂盒供应量的增大、质量管控的提升以及检测效率的提高，会让核酸检测更加准确、快速，帮助医务人员更好地进行防疫治疗！

• 肺部CT能够取代核酸检测吗?

面对核酸检测出现假阴性的状况，有医务人员提出用肺部CT取代核酸检测会更为快速，肺部CT手段简单，直接通过影响判断比较直观，且核酸检测目前排队等待时间长，此时肺部CT相对快速一些。

然而，单纯肺部CT在感染的早期阶段，是无法有效分辨是新冠病毒感染还是其它原因引起的肺炎的。即使在患者发病后期，CT影像高度疑似的情况下，仍然是无法从病因学的角度确认其感染源的，此时仍然需要用核酸检测来最终确定其是否属于新冠感染。因此，荧光RT-PCR核酸检测仍然是最终确认患者是否是新冠病毒感染的金标准。

由于患者发病中后期的CT影像具有比较明显的特异性，本着“宁错勿漏”的原则，在国家卫健委也在第五版诊疗方案中，也已将“疑似病例具备肺炎影像特征者作为当前湖北省中重疫区临床诊断病例标准”。

但是，在其它地区，荧光RT-PCR核酸检测仍然是金标准，辅之以肺部CT的影像学诊断，才是较为科学合理的确诊方案！