干货分享 | 细胞污染的思考（一）

一、细菌、真菌污染的检测

（1）肉眼观察细菌、真菌污染常在传代、换液、加样等开放性操作之后发生，而且增生迅速，若有污染，在48 小时内可明显观察到。如培养液变混浊，或略加振荡有很多漂浮物漂起。

（2）镜下观察在倒置显微镜的高倍镜下可见培养液中有大量圆球状颗粒漂浮，即为细菌污染。若细胞之间有丝状、管状、树枝状或卵形的物质常为真菌污染。

（3）接种观察采用普通肉汤接种或用未加双抗药物的培养液接种，也可发现是否有污染。

二、支原体污染的检测

（1）相差显微镜观察将细胞接种于事先放置于培养瓶内的支持物(一般用长形盖玻片)，24 小时后用清洁尘镊子从培养瓶中取出支持物，细胞面向上放置于载物片上，再盖上较大盖玻片，用相差油镜观察；若不用支持物培养法，直接取少许培养液滴在载物片上，再盖上盖片观察亦可。支原体在镜下呈暗色微小颗粒，多位于细胞与细胞之间，有时可见类似于布朗运动的表现。应注意与细胞破碎溢出的内容物如线粒体等相区别。

（2）荧光染色法观察用荧光染料Hoechst33258，此染料能与DNA 特异地结合，可使支原体内的DNA 着色，然后用荧光显微镜观察。染色方法为：用支持物盖片培养法将细胞接种在盖片上，在细胞汇合前（即未长满前）取出玻片，于碟皿中，用不含酚红的Hanks液漂洗，1:3 醋酸钾固定10 分钟，再用生理盐水漂洗后置于50μg/mL 的Hoechst33258(生理盐水配制)中染色10 分钟，置于蒸馏水漂洗1～2 分钟，向细胞面滴加数滴pH5.5 磷酸缓冲液，然后置荧光显微镜下观察。若用细胞培养液，先离心去除上清液，再加入Hanks 液漂洗，离心弃上清后加入1:3 醋酸甲醇固定10 分钟，再用生理盐水漂洗后去上清液，再用Hoechst33258，DAPI 或者PI 等核染色试剂，染色10 分钟，加入蒸馏水漂洗，离心去上清蒸馏水，加3～5 滴pH5.5 磷酸缓冲液，稍吹打使沉淀细胞重悬浮，用吸管吸出，滴于载物片上，盖上盖片后观察。荧光显微镜下支原体呈绿色小点，散在于细胞周围或附于细胞表面。（4）电镜检测可用扫描电镜或透射电镜观察。一般在细胞培养48～72 小时，细胞接

近汇合前，用胰酶消化细胞制成细胞悬液后进行。需经过固定、包埋、切片后才能进行观察。详细方法同细胞形态观察法。

（5）培养检测将2.5×10^9/L 细胞悬液5mL 加入45mL 支原体肉汤培养基（Sigma 或北京生物制品所生产的均可），培养14 天后观察肉汤培养有无雾状沉淀，然后取0.5ml 加入

已冷却到50℃的培养基中，再用琼脂培养基做分离培养，37℃培养3天观察有无?荷包蛋?菌落出现。

* 培养加荧光核染色是检测支原体污染的黄金搭档。