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重组DNA技术
是识别DNA的特异序列,并在识别位点或其周围切割双链DNA的一类内切酶。限制性核酸内切酶可以把DNA切成长度不同的片段,是重组DNA中重要的工具酶。
(三)目的基因
应用DNA重组技术的目的:分离、获取某一感兴趣的基因或DNA序列;获得感兴趣基因的表达产物(蛋白质)。这些感兴趣的基因或DNA序列就是目的基因。即纯化的特定基因(靶基因)。
基因载体:为携带目的基因,实现其无性繁殖或表达的有意义的蛋白质所采用的一些DNA分子。
在重组DNA中常用的载体包括质粒DNA、噬菌体DNA、柯斯质粒载体(粘粒)、病毒DNA和人工染色体等类型。
基因工程基本原理
(一)目的基因的获取
目的基因主要有以下几种来源:
1.cDNA文库 以mRNA做模板通过反转录的方式获得的DNA。
2.基因组DNA文库 用限制性内切酶切割组织或细胞染色体,得到所需DNA基因片断。
3.聚合酶链式反应(PCR)用体外快速扩增方法得到所需目的基因。
4.化学合成法 已知目的基因的核苷酸序列或其产物的氨基酸序列用DNA合成仪合成。
(二)克隆载体的选择
克隆载体的选择的标准:
①能自主复制;②具有两个以上的遗传标记物便于重组体的筛选和鉴定;③有克隆位点(外源DNA插入点),常具有多个单一酶切位点,称为多克隆位点;④分子量小,以容纳较大的外源DNA。
(三)外源基因与载体的连接
目的基因与载体DNA片段连接成一个完整的重组体分子。
1.粘性末端连接。
2.平端连接。限制性内切酶切割产生的平端、粘端补齐或切平形成的平端。
4.人工接头连接。由平端加上新的酶切位点,再用限制酶切除产生粘性末端,而进行粘端连接。
外源重组DNA导入宿主细胞后,首要任务是要筛选含有目的基因的转化菌并加以扩增。
抗药性标记选择是筛选重组体最常用的方法。
免疫学方法特异性强、灵敏度高,尤其适宜于筛选无任何选择标志的基因。
重组DNA技术操作过程可形象归纳为:
分—分离目的基因 切—限制酶切目的基因与载体 接—拼接重组体 转—转入受体菌 筛—筛选重组体
早期是指用正常的基因整合入细胞基因组,以校正和置换致病基因的一种治疗方法。 目前广义上来讲是指将某种遗传物质转移到患者细胞内,使其在体内发挥作用,以达到治疗疾病目的的方法。
一、疾病基因的发现
二、发展新药物
三、DNA诊断(基因诊断)
四、基因治疗
五、遗传病的防治
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