对肌萎缩侧索硬化发病机制的新认识

肌萎缩侧索硬化（amyotrophic lateral sclerosis， ALS）为一种累及皮质、皮质脊髓束、脑干、脊髓运动神经元的神经变性病，临床表现为四肢及躯干肌肉萎缩，导致运动功能严重障碍甚至呼吸肌麻痹，患者多于 3-5 年内死亡。据统计其发病率为（1.5-2.5）/10 万，5%-10% 为家族性 ALS（fALS）. 其余 90% 以上为散发 ALS（sALS）。该病距首例报道至今已有 147 年，直到近 18 年才取得了重大进步：1993 年有学者发现部分 fALS 患者有 Cu/Zn 超氧化物歧化酶（SOD1）基因突变，开始了 ALS 分子生物学研究的新时代；2006 年又发现绝大多数 sALS 患者神经元和胶质细胞内有反式激活反应（TAR）-DNA 结合蛋白 43（TAR DNA binding protein-43，TDP43）包涵体，找到了主要疾病蛋白；2009 年有学者发现 ALS 有 FUS（fused in sarcoma protein/translocated in liposarcoma，也称 FUS/TLS）基因突变，TDP-43 阴性及阳性的 ALS 有 FUS 包涵体，从而提出了 ALS 为 TDP-43 及 FUS 蛋白病的新观点，并使研究方向移向了 RNA 加工的领域。但是对于 TDP-43 及 FUS 蛋白累积的性质、神经元毒性机制及累积蛋白间的相互关系还缺乏足够认识，大部分 ALS 突变基因尚未找到。国内虽已有相关的文献复习及 SOD1、senataxm 基因、风险 SNP、CYP2E1 基因多态性分析的论著，但有关蛋白病研究报道尚少。现就 ALS 近年进展的主要观点及研究方向的个人认识作一介绍。

一、深入认识 SOD1 基因突变的神经元毒性机制，研究不同类型神经元在 ALS 发病中的地位

SODI 是在 1973 年被发现的抗氧化蛋白，由 154 个氨基酸组成，相对分子质量 34 000，SOD1 基因定位于 21 号染色体，含 5 个外显子。15%-20% fALS、3% sALS 有 SOD1 基因突变（称为 MTSOD1-ALS），是 fALS 中一个最大的亚组，大约有 150 个不同的突变位点。其发病机制目前已作了广泛研究，虽远不十分清楚，但可确定的是其机制并非酶活性丧失，而是毒性蛋白功能放大：（1）由于邻近神经元的胶质细胞突触处谷氨酸转运体（EAAT2）缺陷，使释放的神经递质谷氨酸不能及时得到清除，产生毒性作用，运动神经元兴奋性过度升高，受体反复激活，细胞内钙离子超载引发中毒性的级联反应； （2） MTSOD1 形成错误折叠蛋白，聚集在病变细胞的内质网，发生应激反应，或与调节内质网应激的换能器及其识别体系的 3 个定位于内质网的跨膜蛋白 IRE1（inositol-requiring protein-1）、PERK（PKR-related ER kinase）、ATF6（activating transcription factor-6）、内质网内腔多肽链结合蛋白相互作用，抑制内质网相关的降解，产生内质网应激（但内质网应激为一加速疾病进展或终末期的因素，并不启动疾病）；（3） MTSOD1 聚集物累积于线粒体（特别是脊髓细胞的线粒体）的膜间隙，导致线粒体结构和功能损害，线粒体钙离子缓冲能力、ATP、能量障碍，融合、裂殖能力下降，线粒体蛋白成分改变、输入蛋白量下降；MTSODI 毒性使轴突转运中细胞骨架蛋白结构变化，动力蛋白及动力蛋白激活蛋白聚集，顺向或逆向的轴突转运减慢；（4） MTSOD1 抑制细胞质内蛋白酶体降解通路，抑制错误折叠蛋白的清除；MTSOD1 产生细胞外的超氧化物，增加氧化还原应激；（5）细胞内或外的 MTSOD1 通过不同途径增加活性氧自由基的产生和释放，使小胶质细胞产生炎性细胞因子的级联反应，使运动神经元对谷氨酸中毒易感，抑制星形胶质细胞 EAAT 的功能和表达，进一步加重神经毒性。

MTSOD1-fALS 的相关研究发现 ALS 主要病变在运动神经元，但发病及疾病进展的原因并非运动神经元本身，而是由不同类型的神经元共同参与，各自作用不同，因而提出了细胞非自主性功能（non-cells-autonomous function）的机制（或称非细胞自主变性）。一般认为星形胶质细胞在疾病的启动或进展中有重要地位，而小胶质细胞在终末期有致炎及清除变性细胞的功能，施万细胞的表达可使病程减慢，肌肉、上皮细胞的表达不影响发病和疾病的进展。G85R、G37R 转基因小鼠的运动神经元、中间神经元、胶质细胞、小胶质细胞敲除突变基因实验，证实了不同类型细胞在疾病过程中的上述地位。对 MTSOD-G93A 小鼠症状前期、症状期、晚期、濒死期的对比观察发现，症状期运动皮质、脊髓、三叉神经运动核星形胶质细胞增生增加，而晚期、濒死期脊髓、三叉神经运动核以及濒死期小鼠的丘脑腹侧星形胶质细胞增生增加，伴运动神经元死亡增加，而小胶质细胞激活增加仅出现在濒死期，提示星形胶质增生先于运动神经元变性或同时出现，而小胶质细胞增生发生晚，出现在运动神经元变性后。这些实验均证明了星形胶质细胞在调节运动神经元非细胞自主变性中有重要地位，因此深入研究 SOD1 毒性发病复杂机制，探索与 SOD1 毒性关联的细胞非自主机制，阐明不同细胞类型在发病中的地位，对于延缓疾病发生、减慢进展的治疗措施的研究有十分重要的前景。

二、认识 ALS 疾病蛋白 TDP-43 及 FUS，开展 ALS 发病机制新通道的研究

近年来 ALS 研究取得的关键进步是发现了致病蛋白 TDP43 及 FUS。在以往研究的基础上，人们应用生化、免疫组织化学方法证实 ALS 及额颞叶痴呆 -ALS（FTLD-ALS）的变性运动神经元内的泛素化包涵体为 TDP-43 蛋白，进一步的研究发现该蛋白存在于 90% sALS 患者的尸检脑和脊髓组织，因此认为 TDP-43 为 ALS 的疾病蛋白，泛素包涵体因此改名为 TDP43 包涵体。TDP-43 是 Ou 等在研究 HIV-1 基因表达中发现的 1 个广泛表达的核调节蛋白，由 414 个氨基酸组成，具有 2 个 RNA 识别模体（RRMI、2），N 端有核定位信号（NLS），C 端有甘氨酸富集区，能结合 DNA、RNA，穿梭于胞质与核内，有高度保守性，可调节转录、剪接、RNA 加工、细胞凋亡、细胞分裂、mRNA 的稳定，参与神经元完整性和可塑性调节，广泛分布于各种组织，定位于核内，神经系统内位于神经元、胶质细胞、树突，控制 RNA 转录的剪接。编码 TDP43 的基因 TARDBP 位于 1 号染色体，为一必须有的生存基因，在动物实验中发现 TDP43 完全缺失时胚胎不能存活，条件缺失时产后死亡，杂合的动物出现运动功能障碍，有明显的年龄依赖性，即早期不表现症状，老年后出现症状。目前已发现 30 个不同的 TARDBP 基凶突变，多累及甘氨酸富集区，但突变基因检出频率较低，fALS 检出的频率只有 3%-5%，sALS 的频率为 0.4%-1.5%，总的突变率为 2.7%。

2009 年研究者又发现 ALS 患者的 TDP43 包涵体内存在 FUS 蛋白。FUS 蛋白最早是作为原癌基因融合成分从 1 个有染色体易位的脂肪肉瘤中分离的，系 526 个氨基酸组成的多功能 DNA、RNA 的结合蛋白，N 末端有丝氨酸一酪氨酸 - 甘氨酸 - 谷氨酰胺（SYGQ）富集区，有 2 个 RGG 重复、RRM、甘氨酸富集区、半胱氨酸锌指模体，C 端有非经典的核定位信号区，在核内、胞质均有表达，可在胞内外穿梭，参与细胞增殖、DNA 修复、RNA 及 miRNA 加工、转运、转录调节和维持基因稳定性，可维持神经元的可塑性、树突完整性‘4j。编码 FUS 蛋白的基因位于染色体 16q12，有 15 个外显子，基因突变在 fALS 中的发生频率为 3%-5%，是仅次于 SOD1 的 fALS 亚组；但在 sALS 中发生频率仅为 0.6%-0.7%。该基因目前已发现有 35 个突变，多为错义突变，大部分位于 13-15 外显子，编码精氨酸 - 甘氨酸 - 甘氨酸重复区及 NLS 区，导致 NLS 中断，核转运蛋白介导的入核途径损害，1/3 突变位于编码 SYGQ 及甘氨酸富集区的 3、5、6 外显子，有报道称 C 端突变多见于 fALS，3、5、6 突变多见于 sALS。

ALS 相关的 TDP43 及 FUS 蛋白的发现是 ALS 研究的一个重大事件和转折点。由于大部分 ALS 患者存在 TDP-43、FUS 蛋白的累积，ALS 被认为是一种蛋白病，成为有特殊蛋白聚集的变性病的新成员。含有 TDP43 及 FUS 的包涵体代表 ALS 存在 RNA 蛋白加工功能缺陷，只前已发现的 ALS 相关的基因中除 TARDBP 及 FUS 外还有 4 个与 RNA 处理基因（senataxin、anglogenin、危险因子 enlongator protein 3、运动神经元生存基因）有关。由此启动、加速了变性病以 RNA 加工为方向的发病机制研究，即研究蛋白修饰，蛋白与蛋白、蛋白与 RNA 之间的相互作用，研究转录、转录后蛋白处理如剪接、mRNA 稳定、转运、翻译和 RNA 降解，不仅能了解 RNA 代谢通道改变的原因和机制，也将继续发现更多的疾病蛋白，进一步阐明 ALS 的发病机制。

三、认识 TDP-43 及 FUS 蛋白病的临床表型及病理学特点，加强对 ALS 异质性的了解

TDP-43 蛋白病的临床表型为经典的成人型 ALS，包括无 MTSOD1 的 fALS 及 sALS、孤立的运动神经元病（MND）或下运动神经元病（LMND）、进行性肌萎缩（PMA） 、Guam-ALS，另有 1 例感觉、运动性神经病（但不排除合并有 MND）报道；其相关疾病有额颞叶变性、FTLD-ALS。Pamphlett 报道的 PMA、Geser 等报道的 LMND 和 PMA 只有轻的皮质病理改变，认为 PMA 及 LMND 可能是 ALS 的亚型，应包括在 ALS 及 FTLD-ALS 内。与 TDP-43 相关的 ALS 的病理学特征为 TDP-43 蛋白包涵体，通常分布于运动皮质神经元、胶质细胞、神经突，聚集物呈细丝状、圆形、颗粒状、线串状，分布于胞质，与泛素、p62 蛋白共定位，但与半胱氨酸蛋白酶蛋白 C、磷酸化 tau 蛋白、α- 突触核蛋白及磷酸化的神经丝蛋白不相关，可见于 sALS、ALS- 痴呆、无 SOD1 突变的 fALS。

与 FUS 蛋白相关的 ALS 的临床表型与上述大致相同，但一般认为发病年龄早、上运动神经元症状轻。不典型 ALS 包括 FUS-LMND 及 R52IC 突变表型，常表现为对称性的上肢近端肌肉力弱，以后累及远端，有的表现为对称性盆带肌、胸大肌，远端肌力弱，通常无延髓肌症状、认知改变，上运动神经元症状在疾病后期可出现或不出现，神经病理见到脊髓运动神经元严重丧失，脑干、皮质脊髓束、脑皮质运动神经元轻度改变。R521C 突变表型的发病年龄有年轻化倾向，有些患者有颈肌力弱的垂头综合征。FUS 蛋白相关 ALS 的病理学特征为 FUS 蛋白包涵体，形态及分布与 TDP43 大致相同，但核内常可见轻的免疫染色，大部分患者与 TDP43 共定位，部分患者无 TDP43，只有 FUS 蛋白包涵体，称为 ALS-FUS（nonTDP43）；另外 FUS 蛋白尚见于具有嗜碱性包涵体的青年型 ALS 及中间丝包涵体的 ALS，有作者认为是 ALS 的特殊类型。ALS 相关疾病包含 ALS（痴呆）-FUS、额颞叶变性，额颞叶变性 -FUS（nonTDP-43）者称为不典型 FTLD。

因此 TDP43 及 FUS 蛋白病的发现拓广了对 ALS 临床表型的认识，长期来临床上对孤立的运动神经元病、青年型脊髓型肌萎缩以及以颈肌及近端肌肉发病的下运动神经元病的分类及归属常感困难，对 ALS 进程中表现的 PMA 难以肯定诊断，TDP43 与 FUS 蛋白及其相关基因的突变确认了 ALS 表型的多样性，上述不典型表现或 FUS 基因 R521C 突变的相关类型扩大了 ALS 的临床谱；同样对 FTLD 亚型与 ALS 在临床、病理上的复杂重叠关系，找到了本质联系，TDP-43 及 FUS 蛋白是 ALS 及额颞叶变性的共同病理成分，根据临床表型和疾病蛋白成分可分出不同亚型：FTLD-TDP、FTLD-FUS、FTLD-TDP 及 FUS， FTLD-ALS-TDP、FTLD-ALS-FUS、FTLD-ALS-TDP 及 FUS。不同联合的亚型代表了 FTLD 与 ALS 临床病理相谱中的连续变化的不同点组合，因此 ALS-FTLD 可考虑为 ALS 的重叠性疾病，或者是 ALS 的多系统表现。同时 TDP43 及 FUS 蛋白病还存在于其他神经变性病中，如见于 Guam ALS- 帕金森病复合体、海马硬化性痴呆、阿尔茨海默病、帕金森病和 Lewy 体痴呆、经典 Pick 病、皮质基底节变性、Machado-Joseph 病，FUS 蛋白病还可见于嗜酸性、嗜碱性包涵体病。因此已不能将 ALS 简单认为是“选择性的运动神经元损伤”疾病，但是对于 ALS 表型的异质性及各型间的差别及界限尚不清楚，对 ALS 与相关疾病的重叠或重叠综合征尚无精确了解，对其病理性联结及致病蛋白与其他神经变性病的机制性联系有待于深入研究，因此，正确认识 ALS 疾病表现的多样性及加强异质性的研究必将进一步提高临床诊断水平。

四、认识 TDP-43 及 FUS 蛋白细胞内累积的机制及相互关系，探索 ALS 早期诊断和有效治疗的新靶点

TDP43 及 FUS 蛋白在细胞内的累积包括 2 个过程，即蛋白的错定位和蛋白在胞质累积并形成包涵体，其分子机制尚不十分清楚，但与蛋白错定位及入核通路缺陷有关。核定位信号顺序缺失、核 RRM 缺乏、核转运体系本身缺陷或 TDP43 蛋白翻译后不能与转运体系有效结合、蛋白酶体降解抑制均可导致 TDP-43 在胞质的错定位。Igaz 等制作的表达核定位信号损伤的 TDP-43 转基因小鼠出现了 TDP43 胞质错定位，神经元丧失、皮质脊髓柬变性，类似 FTLD 和原发性侧索硬化表现；Nishimura 等应用 siRNA 沉默核转运蛋白 82 以及敲除入核因子核质蛋白 karyopherin-β1、细胞凋亡敏感蛋白，使胞质内 TDP-43 明显累积；而 TDP-43 相关 FTLD 患者的尸检脑及 ALS 的脊髓标本中，细胞凋亡敏感蛋白表达降低。胞质内累积的蛋白多为截断的 TDP-43 片段，相对分子质量常约 35 000 或 25 000，可结合全长的 TDP43 或其他蛋白形成 1 个或几个复合体，因此 TDP-43 C 末端磷酸化、裂解化、片段化作用以及突变基因均可使蛋白在胞质内累积并形成包涵体。累积物损伤神经元的机制尚不十分清楚，有可能是聚集后启动共聚集，结合全长 TDP-43，使核内功能性 TDP43 减少或结合伴侣蛋白形成无功能蛋白复合物，通过显性，阴性机制形成神经毒性，神经分化过程中损伤轴突生长。FUS 蛋白相关的 ALS 由于缺乏动物模型，其胞质内累积及导致神经变性的机制更不清楚，最近的研究认为 FUS 蛋白 C 端运输活性丧失、入核体系损伤导致胞质错定位，并组装入应激颗粒，提示翻译调节、mRNA 代谢中断可产生不适当的过量的应激颗粒。

FUS 与 TDP43 均为功能结构相似的核内多功能蛋白，病变时被扣留在胞质内，部分 ALS 与 FTLD 患者无 TDP-43 包涵体，只有 FUS 包涵体，这种现象称为 ALS-FUS 与 FTLD-TDP43 不重叠，说明 FUS 蛋白亦为独立类型。有作者认为是由于 TDP43 与 FUS 是 2 个不同类型、相关的 RNA 颗粒，FUS 与应激颗粒有关，而 TDP-43 与加工体有关，均参与应激反应。关于 2 个蛋白间的功能关系，是否是相关蛋白、多功能蛋白还是组成复合体共同发挥作用，尚不十分清楚，它们的共同生化通路或共同启动的生化过程尚不了解。Kim 等制作了保留有 FUS 活性的 TDP 致病片段复合体，在竞争性细胞实验中，通过 RNAi 干扰沉默 FUS 或 TDP 其中任何一个，可减少与其相关的组蛋白脱酰基酶 -6 mRNA 的表达，发现 2 个蛋白重叠占据了与组蛋白脱酰基酶 -6 mRNA 结合位点，证明它们在细胞水平的内源性表达中直接形成功能复合体，并有共同的生化通路。

由于 ALS 临床表现的异质性及其疾病发展阶段的不同表现，早期诊断存在困难，TDP43 及 FUS 蛋白的发现为诊断 ALS 提供了新的生化标志。Noto 等测定了 27 例 ALS 患者脑脊液中的 TDP43 蛋白，并与 50 例神经变性病及炎性疾病比较，发现只有 ALS 患者脑脊液 TDP43 蛋白升高，敏感度达 59.3%，特异度达 96.0%，而低水平的 TDP-43 患者存活时间缩短，因此脑脊液 TDP43 蛋白为一诊断 ALS 有潜力的生化标志。Foulds 等测定了 FTLD 患者的血浆内磷酸化 TDP-43 蛋白，并与脑 TDP-43 病理学比较，发现两者明显相关，可能有潜在的诊断价值。TDP-43 及 FUS 蛋白的发现增加了探索治疗 ALS 的新靶点，虽然对抗谷氨酸毒性通道的治疗研究远未深入（有作者称为“盖子未完全打开”）. 但对疾病机制的新认识增加了治疗靶点，扩大了新的治疗研究方向，如可研究恢复核定位信号、转运体介导的入核功能，抑制细胞内蛋白聚集、改善蛋白加工中的剪接、转录失调，改善胞核及胞质蛋白穿梭功能，抗神经炎性、抗凋亡，以及根据 ALS 的非细胞自主性变性原则，在疾病不同阶段选择治疗靶点，也将提高有效性。

尚应指出 ALS 中有占总体的 6%（fALS 的 10%-20%）是因 SOD1 基因突变引起的，与 TDP43 或 FUS 蛋白病互相排斥。虽然 SOD1-ALS 突变体的错折蛋白在发病中也有作用，少数为不溶性蛋白的包涵体，可累及 RNA 加工，但大部分为可溶性蛋白聚集，说明 SOD1-ALS 有独立的发病机制；而其余 ALS 均有 TDP-43 或 FUS 蛋白累积，但是否只局限于这 2 个蛋白以及是否还存在其他的机制，尚不清楚，加以目前 70% ALS 的致病基因尚未找到，因此 ALS 的发病可能是多机制或者是异质性的，仍然需要进一步探索和认识。

编辑： 雨声