我国中草药资源丰富，中草药在防治疾病、保健营养方面起到不可替代的作用。随着人们对健康的关注，中草药中农药残留的研究变得口益重要。中草药中的农药残留严重影响到中草药的品质和食用安全，与此同时严重制约了我国中药材的出口。因此，不论是为了增加出口创汇，或是满足用药安全的需求，探索中药的农残分析检测的新方法，制定详细的药材农药残留标准，具有重大的意义。
中药材在种植防虫害、调节生长、土壤中残存、采收加工及储藏等情况下均有可能引入农药残留污染，金线莲也不例外。目前，虽然快速繁殖金线莲巳取得成功，实现了工业化生产，但是在培养过程非常容易受到微生物污染。在金线莲栽培过程中，常需要喷洒多菌灵、甲基托布津、新植霉素（链霉素和土霉素的混齐」，由于在本实验条件下，链霉素未出峰，所以文章只探讨了土霉素的测定）等杀菌，这类物质对热、酸、碱和光都很稳定，在自然环境中降解较慢，在土壤和植物上易残留，对人、畜都有一定的毒副作用。有研究表明，多菌灵可引起抽搐、精神恍惚、恶心呕吐、胸闷、头晕等症状，甚至对老鼠的生殖系统产生影响。甲基托布津可以和人体血清白蛋白相互作用，诱导人体淋巴细胞DNA损伤，也是可疑致癌物之一。土霉素对胃、肠、肝脏、牙齿等具一定的损害，还会造成过敏反应、二重感染、致畸作用等。在金线莲使用中，常用的方法有泡饮、炖汤、加上水煎煮提取，随着有效成份的获得，有害的残留农药也进入其中，为保证金线莲的质量和用药安全，对金线莲进行农药残留分析十分必要。
本章节根据多菌灵、甲基托布津、土霉素的理化性质，考察了不同的提取方法、提取溶剂、净化条件、色谱条件，建立了HPLC同时测定金线莲中多菌灵、甲基托布津、土霉素残留量的分析方法，该方法操作简便，样品净化满足液相色谱的检测要求，结果重复性较好，回收率为85.40%-94.28%。
1、主要仪器与试药
1.1 主要仪器
Agilent TC-Cl8（ODS）色谱柱（5μm，4.6*250mm，美国Agilent公司）
LC-20Atvp高效液相色谱仪（口本岛津）
CW-2000超声一微波协同萃取仪（新拓微波溶样测试技术有限公司）
DJ-l0A型倾倒式粉碎机（上海淀久中药机械制造有限公司）
RE-52AA型旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂）
LXJ-IIB型低速大容量多管离心机（上海安亭科学仪器厂）
SHB-III循环水式多用真空泵（河南兄弟仪器设备有限公司）
弗罗里硅土净化小柱，500mg/6mL（上海月旭材料科技有限公司）
1.2 试剂
多菌灵（阿拉丁试剂公司，含量99%；）
甲基托布津（阿拉丁试剂公司，含量99%；）
土霉素（阿拉丁试剂公司，含量97%；）
10个产地金线莲：福建南靖、德化、武平、永春、邵武、华安、江西、四川、广西、云南；经福建医科大学药学院天然药物化学教研室张永红教授鉴定
甲醇、乙睛为色谱纯（国药集团化学试剂有限公司）
乙酸乙醋、丙酮为分析纯（国药集团化学试剂有限公司）
实验用水为二次蒸馏水
2、实验方法
2.1 色谱分离条件
色谱柱：Agilent TC-C18（25cm*4.6mm，5μm）；
流动相：A为0.02mol/L磷酸盐缓冲液（（pH=4），B为乙睛；
梯度洗脱程序：0-10min，5%-5% B；10-20min，5%-45% B；20-40min，45%-45% B；
检测波长：270nm；柱温：30℃；
流速：1mL/min；
进样量：20μL。
2.2 对照品溶液的配制
精密称取多菌灵、甲基托布津、土霉素对照品适量，用乙睛配制成质量浓度为100μg/mL的混合储备溶液，进而再稀释配制成质量浓度为0.1，0.5，1.0，2.0，5.0，10.0，20.0μg/mL的一系列混合对照品溶液。
2.3 供试品的制备和处理
精密称取过80目筛的金线莲粉末5.00g于50mL塑料离心管中，加入乙睛（含0.1%乙酸）溶液20mL，超声提取30min，低速离心l0min，将上清液倒入圆底烧瓶中，残渣用20mL乙睛（含0.1%乙酸）溶液重复提取2次，合并滤液，减压旋转蒸发至干，用5mL乙睛溶解作为供试品溶液。取供试品溶液1mL加入预先用乙酸乙醋活化的弗罗里硅土净化小柱中，待样品提取液到达小柱填料界面时，用10mL乙睛（含0.1%乙酸）-乙酸乙醋（体积比1：1，下同）淋洗固相萃取小柱，收集流出液，减压旋转蒸发至干，用1mL流动相溶液溶解，过0.45μm微孔滤膜，待HPLC检测。
3、结果与讨论
3.1 提取溶剂的选择
根据多菌灵、甲基托布津、土霉素在各种溶剂中的溶解度，选取了乙睛、甲醇、含0.1%乙酸的乙睛作为提取溶剂，结果发现含0.1%乙酸的乙睛提取的样品回收率较高，重现性较好，去除了大部分脂质和色素。而选用纯乙睛和纯甲醇提取时，样品回收率稍差，并且甲醇提取出的杂志较多，给净化带来较大的难度。多菌灵易溶于无机酸及乙酸、而甲基托布津、土霉素在酸性溶液中都较稳定，加入0.1%乙酸，有利于提取和分析且样品中残留的干扰物质相对较少，因此实验选取含0.1%乙酸的乙睛作为提取溶剂。
3.2 样品净化方法的选择
农药残留分析是对复杂基质中的痕量组分进行分析，因此样品提取液需进行有效净化，避免干扰测定。若采用传统的液/液萃取的净化方法，消耗溶剂量大，易形成乳状液，手工操作较为繁琐，故实验采用固相萃取技术对金线莲样品提取液进行净化。实验分别对C18柱，弗罗里硅土柱的净化效果进行了比较。结果表明弗罗里硅土柱的净化效果优于C18柱，其对杂质、色素的的净化效果较好。另外淋洗液的极性对净化效果影响较大，选用极性较大的淋洗液，大量杂质将被淋洗出，不利于杂质的去除，而选择小极性的淋洗液则不利于农药的淋出，采用乙睛（含0.1%乙酸）一乙酸乙醋混合洗脱剂对多菌灵、甲基托布津、土霉素的洗脱能力优于乙睛、乙酸乙醋、甲醇、二氯甲烷等单一溶剂，对多菌灵、甲基托布津的回收率均达到90%以上，土霉素的回收率为85%。
3.3 色谱条件的优化
3.3.1 测定波长的选择
在紫外分光光度计上对多菌灵、甲基托布津、土霉素对照品溶液进行光谱扫描，根据所得紫外吸收光谱可见，多菌灵分别在206nm/和282nm处有最大吸收，甲基托布津在264nm处有最大吸收，土霉素在270nm/和355nm处有最大吸收，综合考虑3种待测组分的最大紫外吸收，选定波长为270nm，在该波长下进行测定，保证了3种待测组分均具有较好的响应值。
3.3.2 流动相的选择
本实验研究了不同流动相及比例对3种待测组分的分离效果：由于多菌灵、甲基托布津与土霉素极性差别较大，为了使色谱峰出峰时间适中，故采用了梯度洗脱方法，梯度程序见“2.1项”；实验还考察了甲醇一乙酸按缓冲溶液、乙睛-乙酸按水缓冲溶液、乙睛-1%甲酸水溶液、乙睛-磷酸盐缓冲溶液等四种不同流动相，结果发现，采用甲醇-乙酸按缓冲溶液作为流动相时，3种待测组分，虽然分离度较好，但是洗脱速度慢，土霉素的色谱峰出现严重拖尾且检测灵敏度低；把甲醇换成乙睛时，未见土霉素拖尾现象得到改善；当流动相组合换成乙睛-1%甲酸水溶液时，在检测土霉素时，有效地减少固定相中残留的硅烷醇的干扰，降低了土霉素的去质子化作用，能够减小土霉素拖尾，但是多菌灵和土霉素分离效果较差；进而把1%甲酸水溶液换成磷酸盐缓冲溶液，并调节pH=4，结果发现3种待测组分在该流动相及上述梯度条件下，能够较好地分离开，减小各色谱峰拖尾，改善峰形，而且保留时间适中，避免因为出峰过快而易受到样品中杂质峰的干扰，适合复杂基质样品的测定。图4-1（A，B，C）多菌灵、甲基托布津与土霉素对照品溶液、空白金线莲样品及空白样品加标的色谱图。
3.4 线性范围、检出限与定量下限
吸取混合对照品系列溶液，进样20μL，按上述色谱条件测定峰面积，重复进样3次，以峰面积（Y）为纵坐标，对照品浓度XCX：μg/mL）为横坐标，绘制标准曲线。多菌灵、甲基托布津与土霉素的线性关系及方法检出限及定量限见表4-1。
3.5 回收率与精密度
在未检出多菌灵、甲基托布津和土霉素的空白金线莲中准确加入一定量的高、中、低三种浓度的混合对照品溶液，按2.1，2.3项方法进行提取、净化、测定，计算各农药的回收率，每个样品平行测定三次，结果见表4-2。各农药的平均加样回收率在85.40%-94.28%，相对标准偏差（RSD）在3.32%-8.13%之间，满足农药多残留分析的要求。
3.6 样品检测
采用该检测方法以及提取条件对10批不同产地的金线莲样品进行提取、净化、测定，结果发现均未检测到多菌灵、甲基托布津与土霉素三种农药的残留。
4、结论
本实验探索确定了提取方法、净化条件、色谱条件，首次建立了同时测定金线莲中多菌灵、甲基托布津、土霉素残留量的分析方法液相色谱测定方法，该方法简便快速，重复性好，符合农药残留检测技术要求，为金线莲的质量控制标准制定提供了依据。
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