SCI TRANSL MED｜表观多组学联合揭示肾透明细胞癌治疗新靶点！

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肾透明细胞癌 (ccRCC) 是最常见的肾癌类型，约占所有RCC病例的85%。高表达缺氧诱导因子 2α (HIF2α) 的ccRCC可以用HIF2α拮抗剂有效治疗，但HIF2α低表达或不表达的肿瘤目前没有特异性靶向治疗。表观遗传学的发展揭露了癌细胞独特的表观遗传脆弱性，可导致特定异常背景下肿瘤的合成致死性，为癌症靶向治疗打开新愿景。

2021年9月29日，Science Translational Medicine（IF：17.956）发表了题为“Aberrant activation of m6A demethylase FTO renders HIF2α^low/− clear cell renal cell carcinoma sensitive to BRD9 inhibitors”的文章，利用CRISPR/Cas9功能研究策略，结合RNA-seq和表观多组学（m6A-seq、ChIP-seq、ATAC-seq和Hi-C）测序，层级筛选，确定了一系列相关基因和蛋白，顺式作用元件和反式作用因子，最终确定了BRD9蛋白可能是HIF2α^low/−ccRCC的潜在药物靶点，其抑制剂I-BRD9具有转化成有效靶向治疗药物的潜能。

下面小编对该文章研究成果进行详细解读：

样本来源

细胞实验：7种ccRCC细胞系

       HIF2α^high: OSRC2、A498和786-O;

       HIF2α^low/−: SLR23、769-P、Caki-2和SLR25。

动物实验：BALB/c nude小鼠

研究思路

主要结论

1.体内CRISPR筛选鉴定脂肪量和肥胖相关基因（FTO）是HIF2α^low/−ccRCC生长所需的表观遗传调控因子

为了确定HIF2α^low/−ccRCC中的细胞内在表观遗传调节因子，研究人员进行了一个基于CRISPR/Cas9的体内筛选研究，构建了含有靶向524个表观遗传调控因子、41个必需基因和162个非靶向的单向导RNAs（sgRNAs）文库，转染786-O (VHL−/−HIF2α^high)和Caki-2 (VHL−/−HIF2α^low/−)细胞后通过囊下注射直接注射到小鼠肾脏中。初筛发现786-O和Caki-2细胞中分别有48个和61个基因下调表达，其中Caki-2细胞中特有基因有29个；进一步对这29个候选基因进行体外敲低功能实验，从中发现FTO对三种HIF2α^low/−细胞增殖的抑制作用较HIF2α^high细胞的更明显，证明FTO是HIF2α^low/−ccRCC生长所依赖的表观遗传调控因子。

图1. 29个候选基因敲低后对786-O和Caki-2细胞生长的影响

2.FTO 通过去甲基化稳定HIF2α^low/−ccRCC中的 BRD9 mRNA

为了确定FTO的下游目标，首先对HIF2α^low/−的769-P和Caki-2细胞系敲低FTO后进行了RNA-seq，发现两种细胞系间差异表达倍数至少2倍的基因有1404个，主要富集在细胞周期、有丝分裂核分裂、细胞骨架组织和DNA复制进程，其中373个预测到含有FTO下游的可用药靶点；随后对敲低FTO的Caki-2细胞进行m6A-seq，发现在GGACC motif上高富集，有4712个峰出现和7604个峰消失；将这373个基因与4712个m6A峰进行交叉比对，产生了拥有176个峰的14个基因；下一步对这些基因进行功能研究，发现FTO敲低后其中的BRD9基因和蛋白下调表达且细胞增殖减缓。YT521-B同源结构家族 (YTHDF) 蛋白是m6A的阅读蛋白，能促进含有m6A修饰的RNA的降解。RIP-qPCR实验发现FTO敲低后， YTHDF2可与BRD9 pre-mRNA互作。综合推断，FTO介导的m6A去甲基化抑制了YTHDF2对BRD9 mRNA的降解。

图2. RNA-seq和m6A-seq联合分析，结合功能实验证明了FTO介导的m6A去甲基化稳定了BRD9 mRNA

3.HIF2α^low/−ccRCC中BRD9的优先表达使其容易受到BRD9的抑制

为了确定BRD9在ccRCC中的表达模式，研究人员查找了TCGA数据库，发现HIF2α/EPAS1和BRD9的表达水平存在显著负相关（r=−0.33, P < 0.001）。使用竞争性增殖试验，发现BRD9敲低后Caki-2 和769-P细胞增殖明显减缓。随后，构建了患者来源的3D器官培养仿生模型，用于重现肿瘤异质性和药物测试反应，建立了两个HIF2α^high和两个HIF2α^low/−患者来源的ccRCC器官系，并用一种BRD9选择性抑制剂（I-BRD9）评估了其脆弱性，发现I-BRD9明显减少了HIF2α^low/−类器官的大小，表明BRD9的靶向治疗可能对HIF2α^low/−ccRCC有效。

图3. BRD9是HIF2α^low/−ccRCC细胞体外生长所需的

4.BRD9调控转录促进HIF2α^low/−ccRCC生长

为了研究为什么HIF2α^low/−ccRCC的生长依赖于BRD9，研究人员进一步深度分析BRD9敲低前后Caki-2细胞的mRNA表达谱变化，应用GSEA分析筛选出4989个差异表达基因。随后，在Caki-2细胞中对BRD9敲低前后进行ChIP-seq确定其下游靶基因，鉴定了9847个与1638个基因相关的峰。下一步，进行了ATAC-seq检测，比较了BRD9敲低前后全基因组的DNA可及性变化，发现BRD9缺失导致开放染色质区域减少了至少40%，减少了32,378个峰的DNA可及性。接着，对RNA-seq、ChIP-seq和ATAC-seq进行联合分析筛选出240个共有基因，定义为BRD9特征基因，并通过KEGG富集到细胞周期、血管内皮生长因子（VEGF）信号传导、Hippo信号传导、碳水化合物的代谢过程以及激活转录因子2的途径等关键通路。此外，从TCGA-肾透明细胞癌数据库中提取了530名ccRCC患者的基因表达数据，发现BRD9特征基因在HIF2α^low/−患者中优先富集。

图4. RNA-seq、ChIP-seq和ATAC-seq联合分析筛选BRD9特征基因

5.BRD9占据ccRCC关键基因的超级增强子

进一步分析ChIP-seq数据，以确定BRD9在Caki-2细胞中的表观遗传作用。对全基因组的BRD9结合位点分析表明，90%以上的结合位点距离最近的转录起始位点>2.5 kb，所有这些位点都含有活跃增强子的标记（H3K27ac、H3K4me1和H3K4me2），并且BRD9与ncBAF复合物的其他组分共同占据增强子；研究还发现 BRD9的信号在562个增强子区域大幅增加，这些增强子比其余的长14.3倍，还检测到高的H3K27ac信号强度，表明形成了新的超级增强子（SE）。其中最大的SE与编码Sox8的基因有关，对Caki-2细胞进行Hi-C分析，显示Sox8的SE通过茎环直接与对应的基因启动子相互作用；接着，通过敲除实验证明了Sox8的表达受BRD9的表观遗传调控。另一方面，用I-BRD9处理Caki-2细胞发现I-BRD9选择性地下调BRD9靶基因，特别是那些与SE相关的基因。

图5. BRD9精确定位在活跃增强子区域

6.Sox17招募BRD9共同结合超级增强子

为了探索BRD9特征基因的转录机制，研究人员分析了BRD9结合的SE区域中已知的转录因子结合motif，发现转录因子——性别决定区Y-box17（Sox17）在HIF2α^low/−细胞中有较高表达水平，Sox17的敲低抑制了两种HIF2α^low/−细胞系的增殖，推测Sox17是HIF2α^low/−ccRCCs的主要转录调节因子。研究还发现Sox17覆盖的基因组空间是BRD9的14.5倍，80%以上与BRD9结合的SE也与Sox17结合；进一步分析ChIP-seq数据和结合功能实验证明Sox17促进了BDR9的结合以激活SE。

图6. 转录因子Sox17招募BRD9结合到超级增强子区域

7.BRD9拮抗剂在体内选择性地抑制HIF2α^low/−ccRCC的生长

鉴于BRD9在HIF2α^low/−ccRCC中的功能重要性，作者研究了它作为药物靶点的潜力，评估了I-BRD9在BALB/c裸鼠上携带VHL突变的三种HIF2α^low/−患者来源异种移植模型的体内疗效，持续服用8周，发现I-BRD9治疗可导致小鼠的肿瘤消退；并且比较了I-BRD9、PT2399（一种HIF2α抑制剂）和舒尼替尼在Caki-2正位异种移植模型中的体内疗效，在24周的治疗期内，发现与PT2399或舒尼替尼相比，I-BRD9的耐受性良好，并显示更高的生存率。

图7. BRD9抑制剂在HIF2α^low/−ccRCC体内展现出抗肿瘤活性

文章总结

本文构建了一个以表观遗传为重点的sgRNA文库，进行了体内 CRISPR/Cas9敲除筛选实验，结合RNA-seq和表观多组学（m6A-seq、ChIP-seq、ATAC-seq和Hi-C）多重测序分析，从FTO、BRD9、新的超级增强子到转录因子Sox17，层层筛选和锁定，揭示了表观遗传调控因子引起的HIF2α^low/−ccRCC的发病机制，并通过评估异种移植模型，发现I-BRD9 给药有效地抑制了肿瘤生长并延长了荷瘤小鼠的存活时间，其疗效优于舒尼替尼，表明 BRD9 是治疗HIF2α^low/−ccRCC的潜在药物靶点，为HIF2α^low/−ccRCC的治疗提供了新方法。

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供稿：高通量测序项目部   吴韫里

参考文献：Zhang C J, Chen L, Lou W J, et al. Aberrant activation of m6A demethylase FTO renders HIF2αlow/− clear cell renal cell carcinoma sensitive to BRD9 inhibitors[J]. Science Translational Medicine, 2021, 13(613): eabf6045.