小云：师兄救我啊！！！我用一年时间收集的样本，然后花费了导师一大笔科研经费，做的高通量测序结果终于拿到了。可是这几千个差异表达基因，实在眼花缭乱，该怎么选择基因去验证了？
胖师兄：哈哈，这个问题我也曾遇到过，我愿称之为“幸福的烦恼”。手头没有待研究的靶基因，测序是最优解。但是测序之后，如何挑选基因又称为难题了。实际上，不止RNA-seq，包括外显子测序、各种非编码RNA测序（miRNA、lncRNA、circRNA和piRNA等）和蛋白组测序等等，都会面对基因筛选的问题，而高通量测序基因筛选的原则都是相通的。
小云：有筛选原则呀，那就是说有的解了，哈哈哈，师兄果然是最胖（棒）的，快快教教我呀，刚好也能给粉丝们参考下。
胖师兄：哈哈哈，被小迷妹夸，自尊心再次得到满足，那我就从宏观到微观，一条条来说。第一条，多组学测序整合出来的数据质量，一般总是优于单组学测序结果的。比如转录组+蛋白组+代谢组，这三种测序手段基本上是一种逐级验证的关系，把这3个测序数据取一个交集，那能很大程度缩小我们的范围，提高准确率。
小云：嗯，这个我也听说过，可以说多组学整合测序除了更花钱这一个缺点之外，其它所有的都是优点，那第二条原则了？
胖师兄：第二条就重要了，要从面汇聚到一条线，也就是说在机制层面，咱总得有个具体的关注点。比如我们前面分享过很多当前热点方向，像铁死亡、肿瘤免疫微环境、线粒体代谢、RNA甲基化等调控通路。这些方向可以是测序前我们就选好了，然后在数据分析时，有意识的往这些方向靠；或者根据测序出的数据具体去寻找调节通路，也就是我们通常见到的GO/KEGG分析（图1）了。
图1 GO分析示意图
小云：哦，原来还有两种方式可以选了，那感觉第二种更客观一些，是吧？毕竟结果出来是啥就是啥，我们提前去预判通路，总会出现不匹配的情况吧？
胖师兄：嗯，你想的挺对的。实际上，第三条，对于直接测序来说，我们会推荐根据测序结果去挑选富集通路；但如果因为经费或者样本问题，无法做测序，那用公共数据挖掘，我们倒是推荐先预设分子机制，通过分析来验证的。
小云：哈哈，主要是师兄你讲的好，我能听明白。对了，我有个疑问，如果我打算选择20个基因来验证，我是挑选10个通路，每个通路选两个基因，还是挑选2个通路，每个通路选10个基因了？
胖师兄：我理解你的意思，不要把鸡蛋放到一个篮子里，想多选几个通路，分担风险。不过必要性不大，因为一般我们筛选的差异通路都是TOP10之内的，验证成功率一般也比较高的，与其广撒网，但都没说清楚，不如第四条，优先深入探讨1-2个通路即可，不要贪多求全。
小云：嗯，了解，那对于同一个通路里，那么多基因，我又该如何筛选了？
胖师兄：这个时候就该第五条，参考PPI或者其它网络（cytohubba及MCODE插件等），筛选关键节点基因（图2）。
图2 MCODE插件寻找网络hub基因
小云：师兄果然是师兄，太厉害了。那从基因层面该考虑哪些参数了？
胖师兄：这个就相对简单了，第六条，我们可以关注差异倍数高（log2（FC）绝对值高，一般是大于1或者2，图3）+显著性高（校正P值＜0.05）+基因表达绝对丰度高(至少在一个样品中的表达量RPKM/FPKM大于50)
图3 基因差异表达倍数统计（log2（FC）
小云：嗯，那具体在验证基因数量以及如何分配验证基因，还有什么建议吗？
胖师兄：第七条，验证基因数量一般不低于10个，有条件的可以加到20个。毕竟还会存在成功率的问题，最终得保持8个左右验证成功的基因。至于基因的类型，我的看法如下，第八条，验证的基因不能全部是研究太多的（已成定论，创新性不足），也不能全部没有研究过（容易是阴性结果）。具体比如说验证10个基因，有3个是研究有定论的（确保有阳性结果）+5个其他疾病中有研究的（50%阳性结果）+2个没有研究过的（提高创新性）
小云：真是一场高汤满满的学习盛宴，师兄你太好了，把我所有的疑惑都解开了。走走走，去哪吃饭你随便挑？
胖师兄：师兄我这几年摸爬滚打的经验都无私分享出来了，这顿饭我该去心安理得的吃，哈哈。等你把验证实验都做完，我觉得还有一顿饭也跑不掉，你估计还会来问我，验证实验结果不理想该怎么办？这些都是我之前趟过的雷，你肯定也避免不了。
小云：好好好，那下次我们就再聊聊“验证实验结果不理想”的问题，感兴趣的小伙伴记得关注我们哦。
小云有话说
测序后的验证基因筛选，是一个综合性问题，甚至在课题设计时就开始要构思的， 同时对研究者对该领域的了解深度是一个大考验。高级生信分析以及定制化数据分析，则是我们提供给大家的尚方宝剑。通过最大限度的整合公共数据整合分析、提供多种数据分析思路，在深度挖掘数据资源的同时，降低假阳性，从数千个差异基因中定位出几十个最具有价值的基因，极大助力我们的研究。我们可以提供如下服务：免费数据评估服务、付费高级生信分析以及定制化数据分析等。有需要的读者，快来咨询小云吧！
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