宏转录组测完之后要不要验证？

OmicShare问答第七期

微生物群落研究多组学技术与应用

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问1：我们用16来测多样性，找到了丰度比较高的种群，想做这几个物种的宏基因组，测序样品该怎样准备呢？

答：16S测的时候，本身样品也是需要提取DNA的，可以将样品分两份或者把样本DNA提取后分两份保留下来。一份做16S，一份留着做宏基因组。

问2：我们用16来测多样性，找到了丰度比较高的种群，想做这几个物种的宏基因组，测序样品该怎样准备呢？

答：16S测的时候，本身样品也是需要提取DNA的，可以将样品分两份或者把样本DNA提取后分两份保留下来。一份做16S，一份留着做宏基因组。

问3：一般为了消除个体差异，平均化样品，我们会做混池测序，那么做16s或宏基因组测序的时候可以这样做么？

答：采样的主要目的是要有生物学代表性，让分析结果有意义。所以混样不混样的重点在于样本处理之后是否还可以解释结果。举个例子，同时土壤微生物研究，如果需要研究几个大地区的土壤微生物的比较，在经费不足的情况下，那可以适当采用混合样本的策略，以在有限的样本资源下尽量表达整个地区的微生物组成。如果只是比较一个小地区的土壤微生物差异，那采用混样策略，很可能因为外界差异不足造成找不出内在的微生物差异。

问4：一个复杂的群落，如何富集某特定种群呢？

答：如果实验能富集，基本没必要测宏基因组。如果不能，那可以尝试提高测序深度，找到一些单菌落，结合其他组学数据，缩小范围，看能不能找到特定物种。

问5：对于小型动物，采样的时候如果不能分离肠道和肠道内容物的话，那么宿主的影响还是蛮大的。如果是这样的话，我们高通量测序的有效数据是很小的，面对这样的问题怎么解决呢？

答：处理这种问题有几个方面可以考虑：1.可以参用实验方法去除宿主污染（例如宏转录组中用去polyA法去宿主mRNA）。2.更直接的方法，加大数据量，通过比对去除宿主污染。3.如果宿主没有参考基因组，在污染大的情况下，几乎没办法。

问6：不做宏基因组，是不是做宏转录组也没有用？

答：不会。也有很多只做宏转录组不做宏基因组的文章，两者关注的点不一样，宏转录组在建库中可能会缺失掉一些RNA或者功能，但实际上宏转录组相关的文章很多， 所以不需要担心这个问题。只是你需要考虑，你的研究要做多细，宏转录组本身是没有问题的。

问7：怎么设置生物学重复，有部分偏离样品怎么办？

答：可以将偏离样品去除。因为微生物本身影响的因素太多，一般难以知道哪个主要因素。这也是我们需要采多样品的原因。二三十个重复是正常的，以保证研究中这些因素是实实在在存在的，而不是随机因素引起的。如果单个组学研究的话，必须要采集多个重复。尤其是肠道微生物研究，因为个体差异太大，采集二三十个重复是很正常的；但相比土壤微生物研究，五六个或10个以内重复依然可以解释得通。但如果本身这个研究就是多组学结合的，有其他结果辅助验证，可以较少样本重复数。

问8：16s测序，哪种注释方法会更容易注释到种呢？

答：很难注释到种。因为16s测序的是其中一个片段。一个片段代表了一个整体，本身已经有偏差；同时因为用的是通用引物，会存在错配等情况，这是另外一个不可预测因素。在OTU分类的时候也存在一定的误差，不是百分百。因此能分类到属已经是一个很好的结果。

问9：宏转录组测完之后要不要验证？用Qpcr吗?

答：如果是群落水平的验证，qPCR可以是一个考虑方法。但要记住宏转录组的微生物含量及其不稳定，qPCR不一定有代表性。最好的方法是找到基因的菌落归属，做一些单个细菌的克隆验证。

问10：正计划做宏基因组，考虑成本问题，所以我想先做16s测序，样本是奶牛瘤胃液和粪样。但是有以下几个问题：

1）case-control每组几个重复较好？

2）16s扩增区选择的依据是？选择哪个更好？

3）16s测序出来的高峰度种群，然后怎么做验证？

4）我们是想做特定状态下奶牛的微生物研究，是做宏转录组好还是做宏基因组好？

答：1）重复问题，还是需要具体问题具体分析。样本是动物并且涉及到粪便，如果分类多，建议每个样品10-15个重复；如果分类少，那么每个样品可以二三十个重复；如果测完16S要做宏基因组，每个样品可能需要3-5个重复，可能会比较保险一些。

2）扩增区选择的依据，有相关文献支持，可以参考这篇文章“Comparison of Species Richness Estimates Obtained Using NearlyComplete Fragments and Simulated Pyrosequencing-Generated Fragments in 16S rRNAGene-Based Environmental Surveys”，V3V4会多一些。

3）高峰度种群不需要验证，16S本身是一个比较准确的分析。如果一定要做验证，可以PCR。

4）特定状态下，看你研究的目标，如果是想看基因有什么功能，那么宏基因组也可以；如果想看基因怎么表达，那么可以宏转录组。

问11：16s要PCR的过程不会影响定量么？

答：会影响定量，但PCR过程影响定量，主要还是引物偏好性的问题与16s选的区域问题。对于PCR扩增来说，如果是同样的循环，他们是等倍数的扩增，数量虽有变化，但相对比例是不变的。