作者：Lucky King
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不做实验，纯生物信息分析的文章可以取巧薅点羊毛，但是实实在在的实验苦功夫不能落下。本周批讲一篇LncRNA和间质转化的paper。嫑找哥要套路，套路来自无数的实践&阅读，化有形于无形，无招胜有招。
长链非编码RNA CASC2通过CASC2/miR-367/FBXW7抑制肝癌细胞的上皮-间质转化
CASC2在肝组织和细胞系中的下调
首先，应用实时荧光定量PCR检测75对HCC组织和癌旁非肿瘤组织中CASC2表达。结果显示，与癌旁组织相比，肝癌组织中的CASC2表达显著降低（图1a）。与非侵袭性HCC相比，侵袭性HCC组织中的CASC2表达显著下调（图1b）。与没有复发的患者相比，CASC2表达在复发的HCC组织中明显降低（图1c）。同时，来自R2的数据：基因组学分析与可视化平台http：//r2.amc，包括GEO和TCGA数据库显示，与正常肝组织相比，肝癌组织中CASC2的表达显著下调（附加文件1：图S1），生信分析与实验结果一致。
此外，作者数据显示，与LO2细胞相比，在所有六种HCC细胞系中可观察到CASC2的显著低表达（图1d）；Hep-3B细胞表达量最高，MHCC-97H细胞水平最低（图1d），因此选择这两种细胞系用于损伤和功能增益实验，易于比较。
总之，数据表明CASC2在HCC中表达明显降低。
CASC2抑制HCC细胞的迁移、侵袭和EMT（功能实验）
首先用pcDNA/CASC2（超表达载体）转染MHCC-97H细胞，用CASC2 siRNA（siCASC2＃1和siCASCC2＃2 干扰RNA）转染Hep-3B细胞（使HCC中CASC2高表达的变低，低表达的变高）。实时荧光定量PCR分析显示，在MHCC-97H和Hep-3B细胞中，pcDNA/CASC2和CASC2-siRNA均显著调控了CASC2的表达（图2a和b）。
在功能上，Transwell测定表明过表达的CASC2可以显著降低MHCC-97H细胞的迁移和侵袭能力（图2c）。另一方面，CASC2沉默显著增强Hep-3B细胞的细胞迁移和侵袭（图2d）。
此外，作者尝试确认CASC2在体内对HCC细胞的功能影响。结果表明，CASC2稳定过表达的MHCC-97H细胞，其肺转移可能性较低；与对照组相比，CASC2低表达的Hep-3B细胞，其肺转移率更高（图2e）。
这些数据表明，CASC2可以在体外和体内抑制HCC细胞的迁移和侵袭。
EMT发展对HCC细胞的迁移和侵袭具有重要意义
探究CASC2是否对HCC细胞EMT（间质转化）发展过程产生影响。在75个HCC样品中进行免疫组织化学染色分析，以探讨CASC2和EMT标记（波形蛋白和E-钙粘蛋白）之间的关联。
将CASC2测定值的中位数定义为临界值，依临界值分为两个亚组（CASC2低/高）。结果表明，与CASC2高表达组相比，CASC2低表达组的E-cadherin表达显著降低，波形蛋白表达明显升高（P<0.01，图3a）。
蛋白质印迹结果与其一致，CASC2过表达可以显著提高E-钙粘蛋白的表达，抑制波形蛋白在MHCC-97H细胞中的表达（图3b）。CASC2沉默降低Hep-3B细胞中E-钙粘蛋白的表达、增加波形蛋白表达（图3c）。
这些结果表明CASC2逆转肝细胞EMT发展。
MiR-367是CASC2的目标
为探索CASC2在HCC细胞中的潜在功能机制，采用几种生物信息学工具（microRNA.org和miRBase）预测CASC2的潜在靶标。
生物信息学工具分析显示：在CASC2基因上具有miR-367潜在结合位点（就是碱基能配对儿，图4a）。
RT-PCR结果显示：肝癌组织中miR-367的表达明显升高（图4b）。Pearson相关性分析显示：在HCC组织中观察到miR-367和CASC2表达之间成负相关（图4c）。
此外，检测了LO2、MHCC-97H、Hep-3B细胞中miR-367的表达。与LO2细胞相比，MHCC-97H和Hep-3B细胞中miR-367表达量均显示出较高水平（图4d）。MHCC-97H中miR-367表达量最高（图4d）。
使用miR-367抑制剂（anti-miR-367）和模拟物分别转染细胞MHCC-97H、Hep-3B，通过RT-PCR验证miR-367敲低、过表达（图4e）。荧光素酶报告基因检测显示：miR-367显著抑制野生型（WT）而不是CASC2的突变型（Mut）3'-UTR的荧光素酶活性（图4f）。
已经确定miRNA是通过与Ago2结合，形成RNA诱导沉默复合物（RISC），RISC是miRNA介导基因沉默所必须的。并且可以通过Ago2免疫共沉淀，从该复合物中分离出来潜在的miRNA靶标。
免疫共沉淀（RIP）测定结果证实miR-367是HCC细胞中CASC2的靶标（附加文件2：图S2A和2B）。
使用生物素标记进行pulldown实验，进一步证实CASC2可以直接与miR-367相互作用。与对照组相比，CASC2下拉的颗粒中CASC2和miR-367含量显著增加（图S2C和2D）。数据显示，CASC2可以负调节HCC细胞中miR-367的表达（图4g）。
另一方面，通过调节HCC细胞中miR-367水平，CASC2表达显著升高（MHCC-97H）或降低（Hep-3B）（图4h）。
总之，这些数据表明CASC2可以直接与HCC细胞中的miR-367结合，并显示了CASC2和miR-367的相互抑制作用。
MiR-367促进HCC细胞的迁移、侵袭和EMT
该部分目的是确认miR-367在HCC细胞迁移、侵袭中的作用。结果表明，miR-367沉默后显著降低了HCC细胞的迁移和侵袭能力，miR-367恢复后显著增强HCC细胞的迁移和侵袭能力（图5a&b）。对75个HCC样品进行免疫组化染色，以探讨miR-367和EMT标记（波形蛋白和E-钙粘蛋白）之间的关联。结果表明：与miR-367低表达组相比，miR-367高表达组的E-钙粘蛋白表达显著降低、波形蛋白表达明显升高（图5c）。
另外，Western印迹分析显示，miR-367沉默增加了MHCC-97H细胞中E-钙粘蛋白的表达，降低了波形蛋白的表达（图5d）。miR-367过表达促进了Hep-3B细胞的EMT过程（图5e）。
因此，我们得出结论，miR-367可以促进HCC细胞的迁移、侵袭和EMT。
MiR-367在HCC细胞中直接靶向FBXW7
为了阐明miR-367对HCC细胞产生影响的潜在分子机制，使用生物信息学工具（microRNA.org和miRBase）搜索miR-367的候选靶标。如图6a所示：在FBXW7 mRNA的3'UTR中存在miR-367的结合序列。已有研究报道，在非小细胞肺癌中，FBXW7是miR-367的下游靶点。此外，已经证实FBXW7是一种肿瘤抑制剂，并且抑制HCC细胞中EMT过程。
假设miR-367可以直接靶向HCC细胞中的FBXW7。使用双荧光素酶报告基因检测、RT-PCR和Western blot分析显示：miR-367可直接靶向FBXW7，并负调节肝细胞中FBXW7的表达（图6b-g）。
进一步探究CASC2是否可以调节FBXW7的表达。数据显示：在HCC细胞中，FBXW7表达可以被CASC2正调控（图6h-k）。
因此，作者得出结论：FBXW7是miR-367的直接靶标，并且由CASC2正调控。
MiR-367/FBXW7介导CASC2在HCC细胞迁移、侵袭和EMT中的抑制作用
作者探究CASC2是否通过CASC2—miR-367—FBXW7对HCC细胞的迁移、侵袭和EMT进程产生抑制作用。
miR-367过表达降低了CASC2过表达MHCC-97H细胞中的FBXW7表达；miR-367敲除后，消除了CASC2基因沉默对Hep-3B细胞中FBXW7表达的抑制作用（图7a和b，附加文件3：图S3A）。
与单独的pcDNA/CASC2转染相比，pcDNA/CASC2和miR-367模拟物共转染的细胞中，miR-367表达显著逆转（附加文件3：图S3B）。在功能上，Transwell测定表明miR-367过表达促进了CASC2过表达MHCC-97H细胞的迁移和侵袭（图7c，附加文件3：图S3C）。
CASC2沉默对Hep-3B细胞迁移、侵袭的转移作用被miR-367敲低后显著逆转（图7d）。
Western印迹表明：miR-367可以显著逆转CASC2对HCC细胞EMT进展的抑制作用（图7e和f，附加文件3：图S3D）。
FBXW7过表达抑制Hep-3B细胞的EMT过程（附加文件4：图S4A）。FBXW7恢复正常后，则消除miR-367对Hep-3B细胞的迁移、侵袭和EMT进展的促进作用（附加文件4：图S4B和4C）。
因此，证明CASC2可以通过CASC2—miR-367—FBXW7发挥对HCC转移的抑制作用。
CASC2和miR-367对HCC患者的临床意义
将每组的中位数定义为临界值，绘制不同的亚组。如表1所示，统计结果表明：CASC2低表达与静脉浸润、高Edmondson-Steiner分级、TNM肿瘤晚期显著相关。miR-367过表达与肿瘤大小、静脉浸润、TNM肿瘤晚期显著相关。
作者认为CASC2和miR-367的异常表达与肝癌转移相关的临床病理特征密切相关。制作Kaplan-Meier生存曲线，分析3年总体生存（OS）和无病生存（DFS）。发现CASC2低表达组的HCC患者与CASC2高表达组相比差异显著（图8a）。
同时，与miR-367低表达组相比，miR-367高表达组HCC患者显示较短的OS和DFS（图8b）。在这四个亚组中，CASC2高表达，miR-367低表达的HCC患者预后最好，而CASC2低表达和miR-367高表达的HCC患者显示最差的预后（图8c）。
这些数据表明，CASC2和miR-367的表达，特别是其组合，有希望可考虑作为HCC患者预后的检测标志物。
Pathway
文章的亮点，有趣处在于：这条调节路线，全是RNA~
文章选择了HCC中两个细胞系，其表达刚好相反，看不懂的同学建议先看一个细胞系再看另一个细胞系。
文章行文大多先说实验然后再说与生物信息学分析相符。孤，深以为，课题设计之初，先分析后实验验证，谁家也不会先拿白花花的银子砸出去。
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