2017年10月《Nature》、《Science》及《Cell》发表文章总结—RNAscope应用...

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导语

2017年10月，在《Nature》，《Cell》，《Science》及其子刊上共在线发表了14篇使用RNAscope方法的文章。这里对其中的6篇文章进行总结。他们分别就巨噬细胞和小胶质细胞感染HIV后成为病毒储存库的机制 [1], 胃部恶性肿瘤中针对干细胞抗原的免疫遗传分析[2]，SHP2在生长板肥大软骨细胞向成骨细胞分化过程中的调控作用[3]，由食物介导的RNA干扰对西方玉米根虫繁殖能力的调控[4]，以及谷氨酸通路在精神兴奋剂成瘾复发中所起的关键作用[5]等进行了研究。此外，在寄生线虫神经肽研究进展前景综述一文中，作者也提及了RNAscope技术[6]。

本文就这些文章内容以及如何通过使用RNAscope技术解决其研究过程中的基因定位需要总结如下。

01

HIV-infected macrophages and microglia that survive acute infection become viral reservoirs by a mechanism involving Bim

HIV会杀死其感染的大部分细胞，而一小部分感染细胞却能存活下来并成为潜在的病毒库，从而对HIV的根除造成障碍。免疫细胞抵抗HIV诱导的凋亡机制至今仍未被明确解释。近期，美国新泽西罗格斯州立大学的Eliseo A. Eugenin及其研究团队证实急性HIV感染导致大量小神经细胞（microglia）/巨噬细胞发生凋亡，而有一小部分感染HIV的细胞存活并抑制病毒的复制。经特殊处理后，它们可以恢复复制产生病毒。作者同时发现，用来作为抗逆转录病毒治疗的HIV融合抑制剂延长了感染HIV巨噬细胞的存活时间。有趣的是，具有促凋亡功能的Bcl-2的负调节物—Bim，在体内及体外潜伏感染HIV的巨噬细胞中上调，并进入线粒体中，提示Bim在巨噬细胞/小神经细胞作为HIV的储存库的过程中起到了作用，并提示Bim进入线粒体可以作为体内病毒储存库的生物标记。

由于缺乏高灵敏度、高度特异的抗体进行HIV病毒gag蛋白水平的检测，在本研究使用了RNAscope技术来检测gag基因mRNA的定位。同时，作者采用了荧光数据分析，相较比色分析，RNA的定位信息更为丰富。作者在同一个细胞里联合使用RANscope与免疫荧光检测， 采用Iba-1标记巨噬细胞， RNAscope 原位杂交技术标记病毒表达的RNA HIV-gag, DAPI 标记细胞核。结果显示在多个时间点的巨噬细胞内均有HIV-gag mRNA存在，而在未感染的培养物中则没有检测到HIV-gag基因转录的mRNA。

上图为一个感染HIVADA 7天后使用HIV-gag RNA探针检测的代表性例子。对照组（即未感染）培养物中无HIV RNA的荧光信号，而HIV处理组则产生了红色的荧光信号。Iba-1（绿色）作为巨噬细胞的标记，而DAPI（蓝色）则用来标记核。

02

Immunogenetic Profiling for Gastric Cancers Identifies Sulfated Glycosaminoglycans as Major and Functional B Cell Antigens in Human Malignancies

近期肿瘤免疫治疗所取得的成功使得人们更加认识到肿瘤免疫机制研究的重要性。日本东京医学和口腔医学大学Shumpei Ishikawa的研究团队分析了胃癌肿瘤浸润B细胞和T细胞免疫遗传库特征，从而揭示肿瘤中B细胞免疫反应的机理。癌症中的体液免疫反应涉及肿瘤特异性的B细胞克隆扩增。作者发现肿瘤中的B细胞库通过体细胞高频突变形成，这一过程可能在有或无阳性选择的条件下发生，如果没有阳性选择，则趋向于产生自体免疫反应。作者确定了硫酸化糖胺聚糖（GAGs）为胃部肿瘤的主要功能性B细胞抗原。此外，在胃癌组织中自然产生的抗硫酸化的GAG抗体显示出强大的针对人体各类恶性肿瘤的抑制功能。

肿瘤细胞呈高度异质性，而且肿瘤特异性B细胞的浸润模式仍然难以捉摸。CDR3是抗体结构中决定抗原特异性的部分，与正常组织相比，肿瘤浸润的抗体IgG具有更广大的抗体谱。由于，免疫组化难以检测分泌型蛋白，因此在这篇文章中，作者设计了针对重建抗体特异性CDR3的mRNA序列的原位杂交探针（分别为#012T-1、#013T-1、#013T-1、#022T-1#、026T-1），证实了在冰冻肿瘤组织样本中该五种肿瘤特异性B细胞的存在。其中，探针013T-1序列适于在福尔马林固定的样本上进行杂交，从而可以开展更详细的检查。下列图中的红色信号点均为使用RNAscope 2.0 HD Reagent kit-RED kit 和RNAscope 2.5 HD Duplex Reagent kit检测到的RNA信号。

03

SHP2 Regulates the Osteogenic Fate of Growth Plate Hypertrophic Chondrocytes

肥大软骨细胞分化为造骨的成骨细胞的分子机制仍未完全清楚。SHP2是一种广泛表达的胞浆蛋白酪氨酸磷酸酶。基因突变造成的软骨细胞内SHP2功能丧失在人类和小鼠中与混合性软骨瘤病相关，提示SHP2在骨架形成中具有重要的作用。为阐明骨骼细胞中 SHP2 的具体分子机制，美国罗得岛州布朗大学Alpert医学院的Wentian Yang在增生和肥大软骨细胞中应用 “Cre-loxP”介导的基因切除技术在特定细胞群内敲除SHP2，以研究SHP2 表达在骨发育中的作用。表达了Col2α1-Cre的小鼠死于妊娠中期。产后在同一细胞群进行SHP2消融则会引起侏儒症，软骨发育异常以及外生骨疣。相反，在表达了Col10α1-Cre的小鼠中，尽管Col10α1阳性细胞中敲除了SHP2， 该小鼠除骨质疏松外表现基本正常。进一步的研究发现，SHP2通过调节SOX9在软骨细胞的丰度，从而发挥作用。SHP2缺陷的肥大软骨细胞中持续增高的SOX9使其向成骨细胞分化，并造成软骨内成骨受损。该研究揭示了在骨骼发育以及稳态过程中，SHP2在调控肥大软骨细胞向成骨细胞的分化过程中起到了重要的作用。

由于该研究中检测的多个标记物均缺乏特异有效的免疫组化抗体，该研究团队使用了RNAscope HD--Brown 试剂盒（Advanced Cell Diagnostics）以及针对小鼠Sox9, Acan, Col2α1, Col1α1, Ctnnb1, Ibsp, Runx2及Mmp13的探针在10µm冰冻切片上进行原位杂交。图为胫骨近端的切片，显示P0.5 SHP2Col10α1CTR和SHP2Col10α1基因敲除小鼠Sox9基因的丰度图像。图中可见SHP2Col10α1基因敲除小鼠的肥大区高度增加，同时伴有肥大区Sox9表达顶层的扩张（在虚线之间）。

04

Control of Western Corn Rootworm (Diabrotica virgifera virgifera) Reproduction through Plant-Mediated RNA Interference

近来转基因玉米中的RNA干扰（RNAi）已经成为一种有希望控制西方玉米根虫（Diabrotica virgifera virgifera）的方法。该方法可以与其它利用蛋白质的根虫控制方法相结合，以提高根系保护并抑制害虫的抗药性。目前，转基因RNAi控制的重点是抑制那些消除后会导致幼虫死亡的基因。美国爱荷华州杜邦先锋的Xu Hu及其研究团队通过RNAi抑制两个生殖基因（dvvgr和dvbol）以控制西方玉米根虫的繁殖。结果表明，在成虫甲壳虫以及幼虫的人工饲料中添加dvvgr或dvbol dsRNA可造成根虫生殖力的下降。此外，从表达dvbol dsRNA转基因玉米根部取食的幼虫中产生的西方玉米根虫甲壳虫，也表现出明显的生殖力下降。这是通过植物介导的RNAi导致昆虫生殖适合度下降的首例报告，证明了以生殖基因作为RNAi靶向目标是控制西方玉米根虫的有效工具。

在本研究中，由于缺乏免疫组化抗体，该研究团队利用RNAscope原位杂交技术方法测定了幼虫vgr和bol mRNA的表达。上图显示不同生活阶段，通过原位杂交技术检测到的vgr和bol mRNA的组织定位。西方玉米根虫的代表性样本切片分别取自卵（1），新生幼虫（2），第三龄幼虫（3），成虫解剖后的睾丸（4）及卵巢（5）。结果显示，在该昆虫的不同的生命阶段，vgr mRNA的表达表现出明显的差异。与vgr基因相比，bol基因在睾丸内高表达，在卵巢内中度表达。其中在第三龄幼虫中以枯草杆菌二氢吡啶二羧酸还原酶（dapB）基因作为RNAscope®阴性对照探针（如下图所示）。

05

The Anterior Insular Cortex→Central Amygdala Glutamatergic Pathway Is Critical to Relapse after Contingency Management

尽管针对精神兴奋剂成瘾的神经生物学机制研究了几十年，目前针对成瘾者唯一有效的治疗方法仍是”应变处理”（contigency manangement），即使用替代性的非药物奖励来维持戒毒的一种行为疗法。然而，当停止使用“应变处理”时，大多数吸毒者会重新使用药物。“应变处理”停止后毒瘾复发的脑机制在很大程度上是未知的。美国马里兰州国立卫生研究院的Marco Venniro及其研究团队创建了一种新的大鼠模型。在此模型中，大鼠只能在可口的食物与自我静脉注射甲基苯丙胺两个选择中二选一，大鼠可以通过选择食物来维持长时间的自愿戒毒。实验证实了由前岛叶皮质到中央杏仁核单突触谷氨酸分泌是停止“应变处理”后毒瘾复发的关键，该神经通路是一个潜在的预防毒瘾复发的治疗靶点。

由于缺乏针对大鼠Drd1和Drd2受体的特异性抗体，作者采用了RNAscope®技术共同标记神经元活性标志物Fos , Drd1 和Drd2 以确定中央杏仁核(central amygdala CeA)和基底外侧杏仁核(basolateral amygdala，BLA)中Fos阳性的细胞类型。研究发现大鼠对甲基苯丙胺的依赖性复发主要与表达Drd1的CeA神经元中Fos的增加有关。上图为毒瘾复发测试组和未测试组中CeA，BLA以及Fos标记的代表性显微照片。箭头指示Fos阳性的典型细胞。同时作者还检测了中央杏仁核的外侧(lateral central，CeL)和内侧(medial central，CeM)细胞中Fos的表达（下图）。

06

Tool-Driven Advances in Neuropeptide Research from a Nematode Parasite Perspective

寄生线虫“组学”数据的扩充促进了对线虫神经系统中假定药物靶点的鉴定。然而，新药物靶点的验证受到种种因素的制约，例如无法在关键的线虫病原体中进行充分定位、功能鉴定以及受体功能研究等。反向遗传学技术已经发展到可在秀丽隐杆线虫中完成基因改造、靶向突变、基因沉默（RNA干扰）以及基因编辑(CRISPR/Cas9)处理。Mousley Angela等人综述了可供寄生线虫神经肽研究的工具的发现、定位以及功能鉴定，并对用于发现新杀线虫剂的工具和技术的适用范围及局限性予以评价。

G蛋白偶联受体 (G-protein-coupled receptor，GPCR)是一种膜结合蛋白，具有七个跨膜结构域，与G蛋白偶联转导细胞外刺激到下游的细胞内信号通路。尽管在一些寄生线虫种类中有神经肽表达的数据，但神经肽GPCRs的定位数据有限。线虫的寄生虫GPCR尚未在转录和蛋白水平上成功定位。这可能是由于信号强度低，以及难以确定其除了七个跨膜区以外其它区域上的合适标为（细胞膜上的区域抗体难以接近）。GPCR定位数据的缺失是了解寄生虫线虫神经肽信号的一个障碍。令人振奋的是，RNAscope原位检测方法可以放大靶标、信号以及探针以增加定位效率。在秀丽隐杆线虫RNAscope荧光检测方法可以在单细胞水平对基因表达进行了定量分析。预示着产生寄生线虫GPCR表达数据一个新时代的开始，这些数据可指导发现药物靶标的功能研究。

未完待续

Reference:

1. Sci Rep. 2017 Oct 9;7(1):12866. doi: 10.1038/s41598-017-12758-w. HIV-infected macrophages and microglia that survive acute infection become viral reservoirs by a mechanism involving Bim.

2. Cell Rep. 2017 Aug 1;20(5):1073-1087. doi: 10.1016/j.celrep.2017.07.016. Immunogenetic Profiling for Gastric Cancers Identifies Sulfated Glycosaminoglycans as Major and Functional B Cell Antigens in Human Malignancies.

3. Sci Rep. 2017 Oct 5;7(1):12699. doi: 10.1038/s41598-017-12767-9. SHP2 Regulates the Osteogenic Fate of Growth Plate Hypertrophic Chondrocytes.

4. Sci Rep. 2017 Oct 3;7(1):12591. doi: 10.1038/s41598-017-12638-3. Control of Western Corn Rootworm (Diabrotica virgifera virgifera) Reproduction through Plant-Mediated RNA Interference.

5. Neuron. 2017 Oct 11;96(2):414-427.e8. doi: 10.1016/j.neuron.2017.09.024. The Anterior Insular Cortex→Central Amygdala Glutamatergic Pathway Is Critical to Relapse after Contingency Management.

6. Trends Parasitol. 2017 Oct 3. pii: S1471-4922(17)30227-1. doi: 10.1016/j.pt.2017.08.009. [Epub ahead of print] Tool-Driven Advances in Neuropeptide Research from a Nematode Parasite Perspective.

「RNAscope技术」微课堂

RNAscope技术是由美国Advanced Cell Diagnostics(ACD)公司研发的RNA原位杂交产品，在近年来的生物检测领域发展迅速。与传统的RNA原位杂交相比，RNAscope技术属于新一代RNA原位杂交技术，其特异性的双Z探针设计避免了传统长链RNA探针的弊端，配以自身级联放大检测原理，可以高效敏感地检测到目标RNA。该技术优势如下：

1. 应用广泛；

2. 高特异性；

3. 极高灵敏度，单分子可视化和单细胞定量；

4. 兼容降解的RNA样本；

5. 无需RNase-free操作和环境要求，一天完成实验；

6. 检测结果稳定一致性，兼容高通量自动化平台；

7. 多通道多靶点同时检测。