作者：解螺旋.子非鱼
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今年已经谢幕的诺贝尔奖，捧红了自噬研究。关于自噬的研究要怎么做，小鱼将简单介绍上述研究流程中必备基本工具及实验策略。
今年已经谢幕的诺贝尔奖，捧红了自噬研究。自噬作为细胞内“清道夫”，已经广为人知。在国自然中，自噬的研究也是如火如荼（具体请看《酸菜：今年国自然如何搭上自噬热点的便车？》）。但是自噬在肿瘤领域中似乎“亦正亦邪”，有时它可启动II型程序性死亡，让肿瘤细胞“一命归西”，有时却又能提高肿瘤细胞对应激的耐受能力，使其“死中求生”。因而，自噬与肿瘤之间的“恩恩怨怨”引得科研界的一众研究者纷纷化身“娱记”，力争挖得第一手“八卦”进行爆料。
其实，自噬就是一把双刃剑，对肿瘤存在促进与抑制双重作用。而这一特性也为肿瘤防治提供了两种截然不同的思路：抑制自噬——提高抗癌治疗效果，或激活自噬——诱导肿瘤细胞发生自噬性死亡。即便如此，两种研究思路的实验研究却是相似的，可以说是殊途同归。那么以文章“Ulinastatin Reduces the Resistance of Liver Cancer Cells to Epirubicin by Inhibiting Autophagy”为栗子，小鱼这就将自噬肿瘤研究的一个入门级参考模板分享给大家。
那么为了更好地玩转自噬研究，小鱼将简单介绍上述研究流程中必备基本工具及实验策略，可使你的实验研究变得事半功倍。
自噬中常涉及的信号通路
正常培养的细胞自噬活性非常低，不便于观察。此时，则可用相应试剂对细胞进行诱导，其后8 min内即可观察到自噬体形成，2h后自噬溶酶体基本降解消失。通常这些试剂是自噬相应信号通路的抑制剂或促动剂，而目前比较肯定的自噬信号通路可大致分为以下3类。
1.抑制类信号通路：1）在Class I PI3k pathway（PI—phosphatidylinositol，磷脂酰肌醇）中，当血糖水平高时，可接收胰岛素受体传来的信号，进而抑制自噬作用。2）依赖mTOR途径的自噬，如PI3K-AKT-mTOR信号通路和AMPK-TSC1/2-mTOR信号通路。
2.激活类信号通路：在Class III PI3K通路中，beclin1和UVRAG作为正调控子，抗凋亡因子bcl-2作为负调控子共同参与调控自噬。其结构上类似于Class I PI3K，但作用却完全相反。
3.其他信号通路：GTP结合的G蛋白亚基Gαi3抑制自噬；GDP结合的Gαi3蛋白活化自噬。死亡相关蛋白激酶（death-associated proteinlinase,DAPK）和DAPK相关蛋白激酶（DAPK-related protein kinase-1,DRP-1）可诱导自噬。
自噬研究相关基因（autophagy associated gene，ATG）
除此之外，一般还需结合遗传学技术对自噬相关基因（ATG）进行干预：包括反义 RNA 干扰技术（Knockdown）、突变株筛选、外源基因导入等，以便鉴定自噬相关蛋白。由于自噬研究的历史关系，很多基因在酵母和哺乳动物中有不同的命名，而NCBI中则介绍了一些较早发现的自噬相关基因，如下表。
同时，小鱼也会列出几个新近发现的ATG基因：
bif-1（Endophilin B1） 和 UVRAG（ultraviolet irradiation resistance-associated gene）：蛋白bif1可通过UVRAG蛋白与Beclin1形成复合物，调节自噬和肿瘤形成。
2）VMP1 （Vacuole membrane protein 1）可促使哺乳动物细胞中自噬小体的形成。
3）DRAM （damage-regulated autophagy modulator）：自噬过程中P53诱导的调节子，在细胞凋亡中起着重要的作用。
4）TP53INP2 （Tumour Protein 53 Induced Nuclear Protein 2）可促使哺乳动物细胞中自噬小体的形成。
自噬的观察与检测
细胞经诱导或抑制后，需对自噬过程进行观察和检测。目前，人们对自噬的检测主要包括基于检测自噬体的直接(观察自噬体的形态)和间接(检测自噬体表面蛋白标记)的方法。
1.电镜下观察自噬体的形态
在电镜下可观察到呈新月状或杯状、双层或多层膜、有包绕胞浆成分的趋势的自噬囊泡（autophagic vacuole，AV）。
自噬体（AVi）的特征为：双层或多层膜的液泡状结构，内含胞浆成分，如线粒体、内质网、核糖体等。
自噬溶酶体（AVd）的特征为：单层膜，胞浆成分已降解。
2. 在荧光显微镜下采用 GFP-LC3 融合蛋白来示踪自噬形成
LC3融合蛋白可分为以下两个体系。
*GFP-LC3单荧光指示体系：利用了LC3在自噬形成时聚集的原理，即无自噬时，GFP-LC3 融合蛋白弥散在胞浆中；自噬形成时，GFP-LC3 融合蛋白转位至自噬体膜。在荧光显微镜下形成多个明亮的绿色荧光斑点，一个斑点相当于一个自噬体，可以通过计数来评价自噬活性的高低。
但是绿色斑点增多并不一定代表自噬活性增强，也有可能是自噬溶酶体降解途径受阻，可以通过western blot 检测游离的GFP、p62来验证（P62与LC3呈负相关的关系）。其中，P62可以反映自噬的强弱。当LC3 II升高，P62同时降低，表明自噬流通畅；如果LC3II升高，P62升高，表明自噬起始正常，但下游不通，吞噬体和溶酶体不能融合。
*mRFP-GFP-LC3双荧光自噬指示体系：用于标记追踪LC3以及自噬流的变化。其中GFP是酸敏感型GFP蛋白，而mRFP是稳定的荧光表达基团。当自噬溶酶体形成后，其内部的酸性环境，可使GFP淬灭。
因此GFP的减弱可指示自噬溶酶体形成的顺利程度，则可通过GFP与mRFP的亮点比例来评价自噬流进程。其中红绿荧光merge后出现的黄色斑点就只是自噬体，而红色的斑点指示自噬溶酶体。如吞噬体和溶酶体能正常融合，那么红色荧光多于黄色荧光，如自噬下游阻滞，吞噬体和溶酶体不能正常融合，则主要为黄色荧光。
3. 通过Western blot检测 LC3-II/I 比值的变化以评价自噬形成
在自噬（Autophagy）形成过程中，胞浆中的微管相关蛋白轻链3（MAP-LC3）会酶解掉一小段多肽形成LC3-I，LC3-I跟磷脂酰乙醇胺即脑磷脂(PE)结合转变为（自噬体）膜型（即LC3-II），因此，LC3-II/I 比值的大小可估计自噬水平的高低。
又因LC3 抗体对 LC3-II有更高的亲和力，会造成假阳性。所以方法 2和3需结合使用，同时需考虑溶酶体活性的影响。
4. MDC染色&CellTrackerTM Green 染色
前者即单丹磺酰尸胺染色，而后者主要用于双染色。两者均能染细胞的液泡，均属于非特异性染色。
自噬相关蛋白定位
在研究自噬相关蛋白时，需对其进行定位。为了区分自噬体与溶酶体、线粒体、内质网、高尔基体等细胞器，常用一些示踪蛋白在荧光显微镜下来共定位：
Note：这些蛋白均为胞浆蛋白，爬片或胰酶消化的细胞在做免疫荧光前需先透膜（permeablize），可采用 0.1% SDS 处理。
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