最近一段时间， CRISPR技术可谓风光无限，刷屏各大主刊，甚至出现4篇CRISPR相关文章同现science的景观。CRISPR技术在当今科研界的地位如何呢？我用一组数据来向大家说明。
从2002年第一篇关于CRISPR的文章出现后，这个方向的研究日益火爆，一年的文章数量将超过3000篇。
当然，文章数量并不能说明CRISPR技术的主要性，文章质量才是关键，通过pubmed搜索可以看到，CRISPR技术相关文章总数已经达到9000多篇，其中三分之一的文章发表在影响因子大于5的杂志上，发表在三大主刊上的文章数高达600多篇。
技术虽好，最重要的还是要会用。下面我就教大家如何利用CRISPR技术进行基因敲除。
例如我们要研究重要的肿瘤抑制子p53，其中最关键的问题就是要敲除p53蛋白，探寻其功能。如何才能有效的进行敲除呢？
设计有效的sgRNA
1. 进入ensemble网站：
http://asia.ensembl.org/index.html?redirect=no。在图示的位置输入需要查询的目的基因p53。
2. 选择继续后，获得以下结果。
3. 选择TP53进入
4. 查看所有转录本，并且选择合适的转录本
5. 进入后，点击外显子
6. 此时我们可以看到PKM2含有12个外显子和11个内含子，第一个外显子均为5端UTR区，起始编码从第二个外显子开始。
在ATG下游100bp左右选择一段外显子DNA序列（也就是第四个外显子区域）：
TCCCCCTTGCCGTCCCAAGCAATGGATGATTTGATGCTGTCCCCGGACGATATTGAACAATGGTTCACTGAAGACCCAGGTCCAGATGAAGCTCCCAGAAT
进入sgRNA预测网站：http://crispr.mit.edu/, 将DNA序列输入其中。
7. 获取sgRNA序列，可以看到，所选的这段DNA中含有16条sgRNA，随后对这项sgRNA进行offtarget打分。分值越高，表明脱靶效应低。
8. 选择sgRNA序列。
9. 根据所选的sgRNA设计引物：
FW: CACCGCCATTGTTCAATATCGTCCG
RW: AAACCGGACGATATTGAACAATGGC
构建cas9-sgRNA质粒:按照常规酶切法构建含sgRNA的cas9质粒。
使用cas9-sgRNA质粒敲除目的基因
1. 在293T细胞中使用慢病毒包装的方式表达cas9，收集病毒上清。
2. 使用病毒上清感染Hela细胞，感染48h后，用含有嘌呤霉素的培养基筛选或者挑单克隆细胞即可获得敲除目的蛋白的细胞系。
至此，我们已经成功利用CRISPR技术敲除了目的蛋白，CRISPR技术这么火，及时掌握应用还是很有必要的。如果你需要Cas9文库产品，可以来吉凯网上商城看看。
吉凯的Cas9文库产品，采用Broad研究所张锋实验室构建的质粒文库，进行扩增后利用高通量测序检测其覆盖度和均一性，用符合文库筛选标准的文库质粒进行慢病毒包装，结合吉凯先进可靠的慢病毒包装工艺，提供满足cGMP标准、可用于动物体内实验的文库病毒。
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