今天要讲的技术，我曾因此受益。当你观察的基因分子量很小的时候，比如8kD，这个技术技术就会很有用。
过去的一段时间，我们集体蒸发。我每天都是2点钟才睡的觉。写标书的时候，会看很多文献，也会系统地梳理手上的课题，收获不小。课题今年不中，明年也会中，也不用很在意，但是这段集中脑力思考课题的过程，很重要。
此外，最重要的感悟就是：
公司分析的转录组测序数据完全不能用，完全不能用。必须自己分析。
所以，我现在坚定地认为，每一个科研团队都需要生物信息人员，如果不能拥有服务器，不要紧，那就先从学习R语言开始，一本万利。
以下是正文：
之前的两周跌宕起伏，具体经历就不讲了，相信大家迟早都会感受到写自科的魅力，写自科时你会发现，自科催人头发白，自科催人头发少，自科摧人睡不着。。。珍惜单纯做实验的时间吧。
用Glycine胶时，低分子量的常常堆积在浓缩胶中，所以来分离小分子不是特别理想，重复性也不大好。所以今天我们主要分享的是做小分子的tricine胶。Tricine胶能有效分离1-100KDa的样品，但100KDa以上我也做过，能做的出来，由于72以上的marker基本都重合了，如果不是万不得已还是不建议用tricine来做，其实步骤方法都还算一样的，只是配方不一样，时间长一点而已。
1. Tris-Hcl SDS （PH=8.45）
182g Tris base（3M）溶于300ml ddH2O，调PH=8.45。
加水至500ml，经0.45mm过滤，加1.5g SDS。
（一定要提前一天配置）
2. 1 × Running Buffer（如果做的多，可以直接配置10X的，如果做一次就配一次的，以免浪费）
Tris base 12.1g
Tricine 17.9g
SDS 1g
ddH2O 定容至1000ml
3. 1 × Blotting Buffer （trans）
Tris base 3g
Glycine 14.4g
甲醇 200ml
ddH2O 定容至1000ml（这里用的甲醇增多，原因详见上回）
有不同的规格，但是我们专门用这个胶来做小分子，便只写16%的胶：
步骤相同的就简略说明一下：
1.配胶：根据玻璃板的不同规格，配置分离胶和浓缩胶。
2.灌胶：1ml加样枪灌分离胶，我这里用的异丙醇压胶，心理作用，无水乙醇我也用过，没有太大影响，常温放置30min；之后灌浓缩胶，立即插入梳子，静止30mim。
3.上样：加同质量同体积的样品，蛋白Marker3-5l。
4.电泳：将配置好的胶放入电泳槽中，倒入1×电泳液，
恒压50V电泳45 min后，到分界处切换至恒压100V，90min（90min一般都可以了，如若要跑到底，基本上需要120min）。
5.电转：甲醇中活化，制备“三明治”，在4℃冷库中，老规矩，恒压105V,105min
6.封闭：用牛奶室温孵育1h，洗膜3次，每次5min。
7.孵育一抗：封闭结束后，4℃孵育一抗过夜。
8.二抗孵育：洗膜3次，每次5min；孵育二抗，室温1h；洗膜3次，每次5min。
9.ECL显影：ECL显影液，A:B=1：1；发光。
10.数据分析：应用Bio-Rad Quantity One software软件对条带灰度值计量分析，测定各条带蛋白表达的强弱。
1.我相信大家基本步骤都是很纯熟的，只是有时候一些小细节可能没有注意到，所以跑Western blot要把心态摆正，把握细节最重要。
2.若只跑一块胶，那槽另一边要垫一块塑料板且有字的一面面向外。电泳液至少要漫过内测的短玻璃板。注意检查是否漏液。
3.加样太快可使样品冲出加样孔，若有气泡也可能使样品溢出。所以加样时要慢慢加。
4.拿滤纸和膜时一定要戴手套或用镊子，因为手上的蛋白会污染膜。转膜液含甲醇，操作时要戴手套，实验室要开门以使空气流通。
1)玻璃没有洗干净，应该要洗得非常干净。
2)过流酰胺和TEMED的加量不合适，加量相对较多，凝胶凝固过快也会胶不平。
3)加完试剂以后没有很好的摇匀，导致有些部位的聚合剂浓度过高，聚合相对较快造成胶不平。
4)注意手法，均匀加入。
5)灌胶后应该用水或者醇压胶面。
6)边缘胶是不容易聚合完全的，灌完胶后要立即加醇覆盖，浓度越低的胶越不要使用双蒸水压顶，另外还可以在压顶试剂如正丁醇中添加少许AP来增加边缘胶的凝聚强度。
7)温度也是影响胶聚合的重要因素，可能为了让胶更快的凝固而把胶放到37度的温箱，由于受热不均匀，也会造成胶聚合不均匀。
1）每次电泳完后，洗净玻璃、胶条和其它附件。
2）避免玻璃边缘（与胶条接触处）破损很重要，尤其是下面和胶条接触的地方。
3）两块玻板没有放的完全对齐，底部不在同一个平面，封条封不严就容易漏。以后每次只要在水平的桌面上仔细对齐两块玻板，再夹紧。用手感觉一下确定在同一平面上后，放到灌胶架并压在封条上，卡紧。注意两边均匀用力，一般不会再漏。
4）胶条一定要干，跑完电泳后，胶条就放在实验台上晾着。
5）下面的胶条注意不要老化，如果有裂纹的话用保鲜膜垫在上面，也可以有效防止漏胶，或者反过来用。
6）可以在海绵垫下再垫一些纸，使得它与玻璃贴的更紧密。或者在玻璃底部用琼脂糖封上。
1）可能因为胶凝的不均匀，聚合的不是很好，灌胶的时候尽量混匀.
2）可能与拔梳子有关，拔梳应该迅速，冲洗加样孔的时候要小心，以免把上样带扭曲；胶配好了用枪吹几下再灌胶，还有就是要等指示剂跑到两层胶交界成一线时，再调高电压。
3）可能是样品的问题，如果盐浓度较高，便会挤压其它条带，致使条带宽窄不一，由于同样的原因，样品在凝胶中的速度会很慢，造成条带走的较慢。
4）每孔上样量不均匀，应确保每孔中上样量一致。
5）可能是系统的ph出了问题，有可能是电极缓冲液，也有可能是凝胶缓冲液，更新缓冲液。
1）首先，玻璃板一定要洗干净。配胶的时候沿管壁缓缓加入各个成分，混匀的时候用轻轻摇匀，如果用枪吹打时要缓慢且不要打到头，以免带入气泡。
2）配胶时混匀要轻，尽量不产生气泡，上胶时要快，枪也不打到底。加完分离胶后用醇封，待其凝固。即使在上胶时液面上有气泡，加水后也会浮上来。
3）国产的只能是缓慢加样，别把气泡加进去。如果加进去了，小心把整个板在桌上敲敲可以让气泡浮上来。
4）浓缩胶中的气泡与插梳子有关，垂直插容易产生气泡，且不容意排除。将梳子倾斜5-10度插入，即使产生气泡也可以也可以通过轻轻晃动梳子使气泡从一侧逸出。
5)还有一个制胶起泡泡的原因，就是配胶的液体全部在四度存放，室温制胶时由于温差及凝胶聚合反应放热的关系，液体中微小的气泡凝固的凝胶中也会放大成可见的较大的泡泡，这种情况在夏天室温较高时更容易出现。避免的方法是将制胶成分中除催化剂外的部分配置后放室温下静置一会儿，减小温差后再加入催化剂制胶。
1）封闭不全。
2）一抗或者封闭液与膜蛋白的交叉反应。
3）一抗或二抗中某些不纯的物质也可以造成背景。
4）抗体浓度太高，或孵育时间太常都可能遇到这种情况。
5) 曝光时间的控制。
(如果一切操作都没问题的情况下其实就是抗体不好)
有同学说可以用预制胶，确实很方便可以节省时间，操作简单，做一般分子都是没有问题的。但是我用过的预制胶最高浓度是15%的，我不知道是不是还有其他更高浓度的，但是用15%的做小分子并不是特别好，小分子分离的也不是特别好，而且做实验总是要知其然知其所以然，否则一出现问题便会无从下手。
联系客服
