在工具病毒使用的过程中使用方法的选择尤为重要，尤其是体内感染时，注射方法的选择在一定程度上也决定了病毒的使用效果。本文中将对神经系统病毒感染常用注射方法予以详细的介绍，并对不同注射方法的适用特性总结比较，供大家在注射方法选择及操作时参考。 脑立体定位注射 脑立体定位注射是神经系统病毒感染最常用注射方法，其具体操作步骤如下： 1. 实验前准备 a.麻醉：小鼠称重后腹腔注射1%的戊巴比妥（剂量为80mg/100g体重），放置于饲养笼内，约5~10 min； b.待小鼠完全麻醉后，用剃毛器将小鼠头部毛发剃除干净。 2. 固定小鼠 a.将麻醉剃毛后的小鼠置于脑立体定位仪上，先将小鼠门齿卡在适配器门齿夹上，轻轻压上门齿夹横杆，调整适配器高度和前后位置，使耳杆可以方便进入外耳道； b. 左手托起小鼠头部，将左侧耳杆插入小鼠耳道并固定，接着将右侧耳杆也插入小鼠耳道，调节左右两侧耳杆使动物头部保持在U型开口的中心位置，先锁紧固定一侧耳杆，后旋紧另一侧耳杆，使动物头部不能晃动，同时旋紧门齿夹螺丝； c. 固定效果检查：鼻对正中，头部不动，提尾不掉，目测头顶位置水平。 3. 暴露头骨及水平校准 a.依次用碘伏和75%酒精对头顶皮肤进行消毒，之后用眼科剪沿中间位置剪开头部皮肤（长约0.8 cm）； b.去除颅骨表面的结缔组织并用双氧水擦拭，暴露出前囟、后囟（图）; c.调整前囟和后囟在同一水平位置，并调整左右两侧平行，将微量注射器针头置于前囟点位置后坐标归零。 4. 病毒注射 a.根据注射脑区位置的横纵坐标找到颅骨表面下针点并标记，移开注射针，小心地用颅骨钻轻磨颅骨，将颅骨打薄至出现裂缝，用1ml医用注射器针头小心挑开颅骨，一定要防止扎到脑组织（如果此过程出血，可用小的医用棉球拉成长条形将血吸走）； b.用PBS冲洗微量注射器3~5次（每次吸取5 μl）； c.吸取病毒：先吸取1μl空气，再吸取1 μl病毒（在空气中测试一下注射器是否通畅）； d.将微量注射器固定在脑立体定位仪上，并与微量注射泵相联，将微量注射器针头经颅骨钻孔处垂直插入脑内目标位置，启动微量注射泵开始注射（注射速度为0.2ul/min），注射完成后，留针5~8 min，缓慢抽出注射器针头。 5. 动物复苏 a.用医用缝合线缝合皮肤，再用碘伏对创口及其附近进行消毒； b.将小鼠从脑立体定位仪上取下，放置于饲养笼内（可在旁边放置电暖器），待其苏醒。 脊髓注射 脊髓注射是脊髓神经节段感染常用的注射方法，其具体操作步骤如下： 1. 实验前准备 a.麻醉：小鼠称重后腹腔注射1%的戊巴比妥（剂量为80mg/100g体重），放置于饲养笼内，约5~10 min； b.待小鼠完全麻醉后，剔除小鼠背部毛发，眼部涂抹金霉素软膏以保持湿润。 2. 脊髓暴露及固定 a.依次使用碘伏和75%酒精对背部皮肤消毒，用一次性手术刀片划开其背部（约在小鼠俯卧时背部隆起最高处）皮肤，尽量去除背部肌肉，暴露其椎骨； b.使用耳杆将小鼠脊椎固定在立体定位仪上，确保稳定，用游丝镊去除覆盖在椎间隙上的肌肉和硬脊膜，可见白色的脊髓。 3. 病毒注射 a.清洗注射器：用PBS冲洗微量注射器3~5次（每次吸取5 μl）； b.吸取病毒：先吸取0.5μl空气，再吸取适量病毒（约0.5ul）； c.将微量注射器固定在立体定位仪上并移至脊髓表面，待其刚好接触脊髓表面时，以45°倾斜插入脊髓内，针头进入距离430μm（相当于垂直深度300μm），留针2min后开始注射（注射速度200nl/min），注射一半体积的病毒后，停止注射并留针2min； d.退针至Z轴深度210μm（相当于垂直深度150μm）处，留针2min，将剩余病毒注射完毕，留针3min后将针头完全退出。 4. 动物复苏 a.将小鼠从立体定位仪上取下，对创口消毒后，将背部皮肤缝合并再次消毒； b.将小鼠放回饲养笼（可在旁边放置电暖器），待其苏醒。 鞘内注射 当感染整个脊髓时，脊髓定点注射的方法便不再适用，这时就需要用鞘内注射，其具体操作步骤如下： 1. 实验前准备 a. 麻醉：将小鼠用异氟烷快速麻醉后，放置于操作台面上，将其口鼻置于连同麻醉系统的软管内，持续给异氟烷使其保持麻醉状态，并在小鼠眼部涂抹金霉素眼膏保护眼睛； b.在小鼠的脊柱注射目标位置下方放置一15ml离心管，使其拱起，用剃毛器将拱起部位毛发剃去。 2. 病毒注射 a.依次用碘伏、酒精对剃毛处皮肤进行消毒； b.用25ul微量注射器吸取适量病毒，用手触摸找到要注射的脊髓节段，对着两个棘突中间位置扎针，当小鼠尾部轻微上翘时表示成功插入髓鞘，此时固定针头，缓慢注入适量病毒（一般5~10ul）; c.病毒注射完稍等片刻，拔出针头，用酒精棉球擦拭皮肤。 3. 动物复苏 关闭气体麻醉系统，将小鼠放回饲养笼内（可在旁边放置电暖器），待其苏醒。 眼部注射 （玻璃体注射） 感染眼部神经细胞时，常用眼部原位注射，其具体操作步骤如下： 1. 实验前准备 a.麻醉：小鼠称重后腹腔注射1%的戊巴比妥（剂量为80mg/100g体重），放置于饲养笼内，约5~10 min； b.小鼠麻醉后，在其眼部涂抹红霉素眼膏以保持眼部湿润。 2. 病毒注射 a.用微量注射器吸取适量病毒备用； b.取完全麻醉的小鼠置于台面上，并给予单一冷光源照射，左手按住头部，稍用力使其眼球部分突出，右手持微量注射器自角膜后缘1mm位置插入玻璃体腔内，针尖先垂直进入，随后倾斜，慢慢推注病毒（一般每只眼1~3ul）； c.病毒注射完毕，慢慢抽出针头。 3. 动物复苏 将小鼠放回饲养笼内（可在旁边放置电暖器），待其苏醒。 尾静脉注射 当感染全身神经系统时常用尾静脉注射，其具体操作步骤如下： 1. 小鼠固定 a.首先提取小鼠尾巴，将其放在鼠笼盖或手臂上，并进行适当安抚； b.然后将小鼠装入固定器（可用50ml离心管改造）中，盖紧盖子，并使其尾巴朝外露出； c.用酒精棉球擦拭小鼠尾巴，使其血管扩张（也可用热水、加热器等）。 2. 病毒注射 a.用生理盐水或PBS将病毒稀释至合适滴度（控制病毒注射体积在100-200 μl）； b.用1ml注射器吸取100~200 μl病毒； c.将小鼠尾巴拉直使其红色静脉清晰可见，在距尾尖1/3处进针，缓慢注入病毒后拔出，用棉球按压注射点1min左右以止血。 3. 动物恢复 将小鼠从固定器上取下，放回原饲养笼中。 注意事项 1. 脑立体定位注射位点精确性要求高，坐标需精确，在正式病毒注射实验前可注射蓝墨水等染料确认注射坐标是否正确； 2. 调平的质量保证了脑区注射点的准确性，确保在开始注射前调整前囟和后囟点位于同一水平面，两点连线左右相同距离的点也处在同一水平面； 3. 操作过程中动作要轻柔，不要盲目用力或暴力操作，避免造成脑损伤、注射器针头折弯等影响实验； 4. 脊髓感染一般每节两个位点即可，若发现感染范围不够可适当增多注射点； 5. 鞘内注射时，异氟烷麻醉起效快苏醒快，但要控制好浓度，过量容易致使小鼠死亡； 6. 鞘内注射时注意控制病毒注射体积，避免鞘内压力增加而造成损伤； 7. 眼部注射时对注射病毒的眼睛做好局部抗菌处理，且下针时注意避开血管； 8. 尾静脉注射在相同剂量的情况下建议注射体积尽量大些，一般每只小鼠注射200ul左右。 最后，对以上注射方法特性总结如下表： 注射方法 适用情况 优 势 不 足 脑立体定位注射 全脑或部分脑区感染 摆脱血脑屏障，感染位点特异，病毒用量少 操作复杂且难度大，对动物损伤较大，感染范围有限 脊髓注射 脊髓特定节段感染 感染位点特异，病毒用量少 操作复杂且难度大，对动物损伤较大，感染范围有限 鞘内注射 脊髓全部 可感染整个脊髓甚至脑部，对动物损伤小 病毒用量大，不能实现位点特异性感染 眼部注射 视网膜等 眼部特异性好，病毒用量少，损伤小 应用较局限，仅适用于眼部感染 尾静脉注射 中枢神经系统 操作简单，感染范围广，对动物无损伤 病毒用量大，无区域特异性，仅PHP.eB、PHP.B、9等跨血脑屏障血清型的AAV适用
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