西红花与红花的抗血栓作用研究

摘  要：目的  比较西红花Crocus sativus水提物与红花Carthamus tinctorius水提物及其主要活性成分的抗血栓作用。方法 SD大鼠随机分为对照组、模型组、西红花酸（50 mg/kg）组、羟基红花黄色素A（50 mg/kg）组、西红花水提物（200 mg/kg）组、红花水提物（700 mg/kg）组和阿司匹林（50 mg/kg）组，大鼠sc肾上腺素建立急性血瘀模型。造模前给予药物干预7 d，观察各组大鼠凝血时间、凝血酶原片段1＋2（prothrombin fragment 1+2，F1＋2）、凝血酶抗凝血酶复合物（thrombin-antithrombin complex，TAT）、蛋白S（protein S，PS）、血流变相关指标、血生化相关指标、纤溶系统相关指标以及右颈动脉病理的变化情况。结果 与模型组比较，各给药组凝血时间显著升高（P＜0.05），血清中F1＋2和PS水平显著降低（P＜0.05、0.01）；除红花水提物组，其余各给药组血清中TAT水平显著降低（P＜0.05）；西红花酸组和羟基红花黄色素A组150 s⁻¹切边率的全血黏度和红细胞压积显著降低（P＜0.05）；西红花酸组、羟基红花黄色素A组和西红花水提物组60 s⁻¹切边率的全血黏度显著降低（P＜0.05、0.01）；西红花酸组、羟基红花黄色素A组和红花水提物组10 s⁻¹切边率的全血黏度显著降低（P＜0.05、0.01）；各给药组红细胞聚集指数显著降低（P＜0.05）；各给药组大鼠血清中三酰甘油（triglycerides，TG）、总胆固醇（totalcholesterol，TC）和高密度脂蛋白胆固醇（high density lipoproteincholesterol，HDL-C）水平显著降低（P＜0.05）；西红花酸组和羟基红花黄色素A组血清中天冬氨酸转氨酶（aspartateaminotransferase，AST）活性显著降低（P＜0.05），西红花酸组、西红花水提物组和红花水提物组血清中丙氨酸转氨酶（alanineaminotransferase，ALT）活性显著降低（P＜0.05）；各给药组血清中纤溶酶激活物抑制物（plasminogenactivator inhibitor，PAI）和D-二聚体（D-dimer）水平显著降低（P＜0.05、0.01），西红花酸组和西红花水提物组血清中6-酮-前列腺素F1a（6-keto-PGF1a）水平显著升高（P＜0.05）；各给药组大鼠血管内皮脱落减少。结论  西红花酸的抗血栓作用优于羟基红花黄色素A，西红花水提物的抗血栓作用优于红花水提物。

血栓发病危险性高、治愈率低，给人类健康造成了极大的威胁。全球范围内每年因脑血栓、冠心病、脑梗塞等疾病而死亡的人数逐年增加，接近世界总死亡人数的1/4^[2]。因此，寻找能够预防和治疗血栓形成且不良反应少的新药具有重要临床意义。

西红花Crocus sativus L.为鸢尾科番红花属球根类植物，别名番红花、藏红花，其药用部位为干燥柱头，主要活性成分为西红花苷类（西红花酸、西红花苷）和西红花苦苷等成分^[3]。其味辛、性温，具有活血化瘀、生新镇痛、健胃通经之效。现代药理学研究表明，西红花具有抗心肌缺血损伤^[4]、调血脂^[5]、抗血栓^[4,6]、抗脑缺血再灌注损伤^[7-8]、抗炎^[9]、降血压^[10]以及改善精神类损伤^[11]的作用。

红花Carthamus tinctorius L.为菊科红花属1年或2年生植物，别名草红花、刺红花、杜红花等，为我国道地植物药材，主要分布于新疆、河南、浙江、四川等地，药用部位为干燥管状花，其主要活性成分为羟基红花黄色素A、黄酮类的山柰酚等查酮苷类成分。其味辛、性温，归心、肝经，具有活血、润燥、止痛、散肿通经的功效，常用于治疗痛经、血脉闭塞、跌打损伤、心绞痛，对心血管类疾病具有显著的治疗效果，在血栓^[12-13]、脑缺血再灌注损伤、心肌损伤、冠心病和高血压等疾病^[14-16]的预防与治疗等领域有着很大的开发潜力。

西红花、红花为活血化瘀的经典药材，在我国药用历史悠久，尤其在心脑血管疾病治疗领域，药用价值十分丰富。二者虽来源于不同科属的植物，共同化学成分极少，但名称相似，药用部位外形、药性与功效相近，导致临床治疗与销售市场上对二者的使用出现混淆，造成用药差错。基于西红花、红花皆有抗血栓的作用，本研究通过建立急性血瘀大鼠模型，观察西红花水提物、西红花酸、红花水提物、羟基红花黄色素A的抗血栓作用，对比研究药物对血栓的治疗作用差异及可能作用机制。

1  材料

1.1  动物

SPF级雄性SD大鼠56只，7周龄，体质量240～260 g，购自昭衍（苏州）新药研究中心有限公司，动物合格证号201920610。大鼠于室内明暗循环12 h适应性饲养4 d，自由进食饮水。动物实验经浙江工业大学实验动物中心批准（批准号20191018090）。

1.2  药材

西红花购自浙江省建德市圣火农业开发有限公司，红花购自安徽马鞍山珍品源中药材有限公司，经浙江工业大学王平教授鉴定分别为鸢尾科植物番红花C. sativus L.的干燥柱头、菊科植物红花C. tinctorius L.的干燥花。

1.3  药品与试剂

西红花酸（质量分数＞97%，批号20190613）为本实验室自制；羟基红花黄色素A（质量分数为90%，批号R25A9F59977）购自上海源叶生物科技有限公司；阿司匹林肠溶片（批号H37023270）购自辰欣药业股份有限公司；盐酸肾上腺素（批号Y03J7C15662）、苏木素-伊红（HE）染色液（批号检测试剂盒（批号20190823-30674A）、凝血酶抗凝血酶复合物（thrombin-antithrombin complex，TAT）检测试剂盒（批号20190823-30671A）、纤溶酶激活物抑制物（plasminogen activatorinhibitor，PAI）检测试剂盒（批号20190823-30862A）、蛋白S（protein S，PS）检测试剂盒（批号20190825-30302A）、D-二聚体（D-dimer）检测试剂盒（批号20190820-30086A）、6-酮-前列腺素F1a（6-keto- PGF1a）检测试剂盒（批号20190824-30025A）购自上海酶联生物科技有限公司。

1.4  仪器

LBY-N7500B型自动血液流变仪、LBY-XC40型红细胞自动沉降率测量仪（北京普利生仪器有限公司）；BX43型显微镜（日本Olympus公司）；RM2016型病理切片机（上海徕卡仪器有限公司）；7020型全自动生化分析仪（日本日立公司）。

2  方法

2.1  药物的制备

2.1.1  西红花酸混悬液的制备  取西红花酸700 mg，研磨成粉，加入0.5%羧甲基纤维素钠（CMC-Na）溶液，充分混匀，配制成质量浓度为5 mg/mL的西红花酸混悬液。

2.1.2  羟基红花黄色素A混悬液的制备  取羟基红花黄色素A 700 mg，研磨成粉，加入0.5% CMC-Na溶液，充分混匀，配制成质量浓度为5 mg/mL的羟基红花黄色素A混悬液。

2.1.3  西红花水提物的制备  称取西红花干燥柱头粉末200 mg，加入10 mL蒸馏水，超声30 min，滤过，即得质量浓度为20 mg/mL的西红花水提物。

2.1.4  红花水提物的制备  称取红花干燥粉末700 mg，加入10 mL蒸馏水，超声30 min，滤过，即得质量浓度为70 mg/mL的红花水提物。

2.1.5  阿司匹林混悬液的制备  取阿司匹林肠溶片700 mg，研磨成粉，加入0.5%CMC-Na溶液，充分混匀，配制成质量浓度为5 mg/mL的阿司匹林混悬液。

2.1.6  盐酸肾上腺素溶液的制备  取盐酸肾上腺素10 mg，加入无菌蒸馏水溶解，定容至10mL，即得质量浓度为1mg/mL的盐酸肾上腺素溶液。

2.2  造模、分组与给药

SD大鼠随机分为对照组、模型组、西红花酸（50 mg/kg）组、羟基红花黄色素A（50 mg/kg）组、西红花水提物（200 mg/kg）组、红花水提物（700 mg/kg）组和阿司匹林（50 mg/kg）组，每组8只。各给药组ig相应药物（10 mL/kg），对照组、模型组ig等体积0.9%氯化钠溶液，1次/d，连续8 d。参考文献方法^[17]并优化，建立大鼠急性血瘀模型，第7、8天给药1 h后，除对照组外，其余各组大鼠sc 0.1%肾上腺素（0.8 mg/kg），2次/d，间隔4 h；第1次sc 0.1%肾上腺素2 h后，将大鼠浸入0～2 ℃冰水中冰浴刺激5 min，完成造模。

2.3  西红花和红花对急性血瘀模型大鼠凝血作用的影响

根据文献方法^[18]，于第7天第2次sc肾上腺素1 h后，距大鼠尾部5 mm处剪破出血，将血滴于清洁载玻片上，血滴直径保持5～10 mm，并立即开始计时，每10秒用干燥6号针头将血滴由外向内轻挑1次，2 min后可缩短时间间隔，改为每2～5秒挑1次，至挑起纤维蛋白丝时，即记录为凝血时间。给药结束后，大鼠禁食不禁水12 h，ip戊巴比妥（30 mg/kg）麻醉，腹主动脉取血，按试剂盒说明书检测血清F1＋2、TAT和PS水平。

2.4  西红花和红花对急性血瘀模型大鼠血流变相关指标的影响

采集血液于含肝素的抗凝管中，采用自动血液流变仪与红细胞自动沉降率测量仪测定3个切边率（150 s⁻¹、60 s⁻¹、10 s⁻¹）下的全血黏度、红细胞压积和红细胞聚集指数。

2.5  西红花和红花对急性血瘀模型大鼠血生化相关指标的影响

给药结束后，大鼠眼眶采血，3000 r/min离心20 min，取血清，采用全自动生化分析仪测定三酰甘油（triglycerides，TG）、总胆固醇（totalcholesterol，TC）、高密度脂蛋白胆固醇（high density lipoproteincholesterol，HDL-C）水平和天冬氨酸转氨酶（aspartateaminotransferase，AST）、丙氨酸转氨酶（alanine aminotransferase，ALT）活性。

2.6  西红花和红花对急性血瘀模型大鼠纤溶系统指标的影响

按试剂盒说明书检测血清中PAI、D-dimer和6-keto-PGF1a水平。

2.7  西红花和红花对急性血瘀模型大鼠右颈动脉病理变化的影响

大鼠脱颈椎处死，取右颈动脉，于10%中性福尔马林溶液中固定，石蜡包埋切片，进行HE染色，于显微镜下观察右颈动脉病理变化。

2.8  统计学处理

采用SPSS 19.0软件进行数据分析，数据以表示，组间差异比较采用t检验。

3  结果

3.1  西红花和红花对急性血瘀模型大鼠凝血作用的影响

如表1所示，与对照组比较，模型组大鼠凝血时间显著缩短（P＜0.05），血清中F1＋2、TAT和PS水平显著升高（P＜0.05、0.01）；与模型组比较，各给药组凝血时间显著升高（P＜0.05），F1＋2和PS水平显著降低（P＜0.05）；除红花水提物组，其余各给药组TAT水平显著降低（P＜0.05）。

3.2  西红花和红花对急性血瘀模型大鼠血流变相关指标的影响

如表2所示，与对照组比较，模型组3个切边率的全血黏度、红细胞压积和红细胞聚集指数均显著升高（P＜0.05）；与模型组比较，西红花酸组、羟基红花黄色素A组和阿司匹林组150 s⁻¹切边率的全血黏度和红细胞压积显著降低（P＜0.05）；西红花酸组、羟基红花黄色素A组、阿司匹林组和西红花水提物组60 s⁻¹切边率的全血黏度显著降低（P＜0.05、0.01）；西红花酸组、羟基红花黄色素A组、阿司匹林组和红花水提物组10 s⁻¹切边率的全血黏度显著降低（P＜0.05、0.01）；各给药组红细胞聚集指数显著降低（P＜0.05）。

3.3  西红花和红花对急性血瘀模型大鼠血生化相关指标的影响

血生化指数与机体器官、血液的代谢联系密切，血生化指数异常会引起血液异常，间接促进血栓的形成^[19]。AST、ALT为反映机体血瘀、血栓状态的初步指标。高脂血症是代谢综合征的重要组成部分，可以激活血小板、促进血小板活化、导致血栓形成，TG、TC和HDL-C是高脂血症的代表性指标。如表3所示，与对照组比较，模型组大鼠血清中TG、TC、HDL-C水平以及AST、ALT活性均显著升高（P＜0.01）；与模型组比较，各给药组大鼠血清中TG、TC和HDL-C显著降低（P＜0.05），西红花酸组、羟基红花黄色素A组和阿司匹林组血清中AST活性显著降低（P＜0.05），西红花酸组、阿司匹林组、西红花水提物组和红花水提物组血清中ALT活性显著降低（P＜0.05）。

3.4  西红花和红花对急性血瘀模型大鼠纤溶系统指标的影响

如表4所示，与对照组比较，模型组血清中PAI和D-dimer水平显著升高（P＜0.05），6-keto-PGF1α水平显著降低（P＜0.05）；与模型组比较，各给药组PAI和D-dimer水平显著降低（P＜0.05、0.01），阿司匹林组、西红花酸组和西红花水提物组6-keto-PGF1α水平显著升高（P＜0.05）。

3.5  西红花和红花对急性血瘀模型大鼠右颈动脉病理变化的影响

如图1所示，与对照组相比，模型组大鼠动脉血管内皮细胞从血管壁脱落；与模型组相比，各给药组大鼠血管内皮脱落减少，其中西红花酸组和羟基红花黄色素A组抑制血管内皮脱落作用更佳。

4  讨论

本研究结果显示，sc肾上腺素增强大鼠血管收缩作用，冰浴刺激引起的机体应激反应加速内源性肾上腺素的分泌，从而加剧血管痉挛、增加内压，最终导致大鼠血管内皮细胞损伤，并导致大鼠凝血和纤溶系统紊乱。高凝状态与血栓前状态是等同概念^[20]，可以使机体处于容易发生血液凝固或血栓形成的病理过程。凝血酶是血栓前状态中的重要凝血因子，生理条件下，凝血酶极易被抗凝血酶共价结合生成TAT^[21-22]。F1＋2为凝血酶原被激活后生成的多肽片段，是机体内凝血活化早期敏感的分子标志物，可作为早期判断血栓形成的诊断指标之一^[23]。PS是由肝细胞合成的依赖维生素K的抗凝蛋白^[24]。抗凝血酶、蛋白C系统是机体内的主要抗凝血因子。大鼠体外的凝血时间是考察血液凝固系统的初步指标，血栓的加重一般伴随凝血时间的缩短。本研究发现，与对照组相比，模型组大鼠凝血时间显著降低，血清中F1+2、TAT和PS水平显著增加，表明急性血栓形成的过程中对以上指标有直接或间接的作用；各给药组能够延长凝血时间，降低F1＋2、TAT和PS水平，表明各给药组具有抗凝血作用，西红花酸对凝血酶的调节作用优于羟基红花黄色素A、西红花水提物和红花水提物。

纤维蛋白溶解系统对保持血管壁的正常通透性、维持血液的流动状态与组织修复起着重要作用，纤溶系统中的相关参数可作为评价血栓形成的重要指标。PAI为纤溶酶原激活物抑制因子，参与纤溶系统反应，间接作用于血栓溶解^[25]；D-dimer是纤维蛋白活化、水解后产生的特异性降解产物，D-dimer水平可反映血管内血栓形成情况^[26]；6-keto-PGF1α为前列环素的代谢产物，前列环素由血管壁内皮细胞产生，具有较强的抑制血小板聚集和血管收缩作用，由于前列环素不稳定，常通过检测体内6-keto-PGF1α水平考察血栓形成情况^[27]。本研究发现，急性血栓模型与纤溶系统有关，西红花水提物与红花水提物及其单体成分的抗血栓作用可通过纤溶系统的内部调控，促进血栓溶解；西红花酸和西红花水提物显著升高6-keto-PGF1α水平，而红花水提物和羟基红花黄色素A无明显作用，提示西红花酸与西红花水提物可能通过抑制血小板、降低血管内压、舒张血管，从而抑制血栓形成。

结果显示，西红花酸组和羟基红花黄色素A组全血黏度、红细胞压积、聚集指数均显著降低，各给药组TG、TC和HDL-C水平均显著降低，西红花酸组和羟基红花黄色素A组血清中AST活性显著降低，西红花酸组、西红花水提物组和红花水提物组血清中ALT活性显著降低，表明西红花酸和羟基红花黄色素A作用优于西红花水提物和红花水提物。模型组大鼠血管管腔部分内皮细胞从血管壁脱落，表明造模过程中血管内皮受到损伤，血管内皮细胞着壁黏附力不强，造成脱落，与血管内皮损伤的急性血瘀模型相符；给予药物干预后，大鼠血管管腔无阻塞现象，血管内皮细胞脱落情况减少，甚至部分无脱落，表明西红花水提物和红花水提物及其单体成分可以改善大鼠颈动脉的病理学变化。

综上所述，西红花酸、羟基红花黄色素A、西红花水提物和红花水提物具有显著的抗血栓作用，能够缓解血管内皮损伤造成的大鼠颈动脉血管病理变化。西红花酸对凝血酶的调节作用优于羟基红花黄色素A，西红花水提物对凝血酶的调节作用优于优于红花水提物；西红花水提物和西红花酸能够全面改善纤溶系统相关指标；西红花酸和羟基红花黄色素A对生化指标的改善作用优于西红花水提物和红花水提物。

利益冲突  所有作者均声明不存在利益冲突

参考文献（略） 

来  源：江山山，蒋锦燕，李桥桥，林素素，方乐轩，童应鹏，王  平． 西红花与红花的抗血栓作用研究 [J]. 中草药, 2021, 52(12): 3584- 3590.