人参皂苷Rg1对阿尔茨海默病转基因小鼠的神经保护作用

摘 要：目的  探究人参皂苷Rg₁对APP/PS1双转基因模型小鼠认知障碍、氧化应激损伤、炎症反应、Aβ堆积和神经细胞凋亡的改善作用。方法 采用Morris水迷宫实验，对APP/PS1模型小鼠的认知功能进行评价；采用试剂盒和ELISA法对各组小鼠氧化损伤和炎症相关指标进行测定；采用HE染色和Western blotting法对各组小鼠海马组织神经元凋亡及凋亡相关蛋白进行定量分析。结果 人参皂苷Rg₁能够显著改善APP/PS1双转基因模型小鼠的认知功能，降低Aβ堆积及丙二醛（MDA）水平，提高超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-P_X）、过氧化氢酶（CAT）活性。此外，人参皂苷Rg₁还可通过显著性降低APP/PS1小鼠血清肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、γ干扰素（IFN-γ）、白细胞介素-1β（IL-1β）和IL-6水平，增加IL-2水平，从而抑制神经炎症反应。HE染色显示人参皂苷Rg₁能降低海马细胞的凋亡状态。人参皂苷Rg₁还可以显著升高海马中Bcl-2/Bax的值，并显著降低Caspase-3、Caspase-9和Cyt-c蛋白的表达水平。结论  人参皂苷Rg₁能够显著改善APP/PS1模型小鼠的氧化应激状态，减轻炎症反应，抑制神经元凋亡和改善认知功能。

阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease，AD）是一种多发于老年人且严重威胁老年人生命健康的中枢神经退行性疾病^[1-3]。其主要的临床病理特征是β样淀粉蛋白堆积（β-amyloidplaques，Aβ斑块）、tau蛋白过度磷酸化后形成神经纤维缠绕以及氧化应激、炎症和大量的神经元丢失。其主要的临床表现为渐进性认知功能障碍以及人格改变、语言障碍等神经精神症状，严重影响患者的社交与生活功能。随着世界老龄化人口的不断加剧，AD也越来越受到人们的关注与重视；虽然近来的研究在AD的机制探索与疾病治疗过程中取得了较大进步，但是关于AD的病因及其发病机制仍未阐释清楚；目前仍缺乏高效、确切的治疗手段^[4-7]。

研究发现氧化应激是AD病理过程中最早的应激事件，同时也是引起细胞凋亡的一个主要因素。有研究表明AD患者和AD模型小鼠脑组织中的活性氧（ROS）、丙二醛（MDA）等氧化应激标志物含量明显增多；过多的自由基堆积能够引起生物大分子损伤，使得蛋白质、DNA和脂质等发生过氧化，进而加速神经细胞凋亡，诱发或加重AD病程。这些研究表明氧化应激和细胞凋亡在AD的发生及发展中发挥着重要作用；因此抗氧化和抗凋亡研究成为AD药物研发的热点^[8-10]。炎症是Aβ沉积引起的

人参皂苷Rg₁是人参的主要活性成分，能够通过血脑屏障进而发挥脑保护作用。文献表明，人参皂苷Rg₁对脑缺血和血管性痴呆大鼠的认知功能障碍具有明显改善作用；并且能够改善慢性束缚应激导致的小鼠学习记忆功能障碍，抑制海马CA1区细胞凋亡。人参皂苷Rg₁还可抑制D-半乳糖诱导的衰老模型大鼠机体氧化应激损伤；对于Aβ_1-42诱导的原代皮层神经元线粒体功能损伤也具有显著性保护^[13-17]。然而，人参皂苷Rg₁对于异常的认知障碍和病理学变化的潜在保护作用机制仍不十分清楚。

因此，本研究采用APP/PS1双转基因AD模型小鼠，利用人参皂苷Rg₁进行干预，观察人参皂苷Rg₁对AD小鼠的学习记忆能力的影响和血清氧化应激和炎症相关指标的改善作用，及其对于AD小鼠的脑组织凋亡相关蛋白的表达和神经病理形态变化的调控作用，探讨人参皂苷Rg₁对于AD的治疗作用及其潜在的作用机制。

1  材料

1.1  药品与试剂

人参皂苷Rg₁（质量分数≥98%，批号B10762）购自上海生物化学研究所；MDA、超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-P_X）、过氧化氢酶（CAT）、TNF-α、γ干扰素（IFN-γ）、IL-1β、IL-6、IL-2检测试剂盒均购自南京建成生物工程研究所；Bcl-2、Bax、Caspase-3、Caspase-9、Cyt-C抗体购自武汉爱博泰克生物科技有限公司。

1.2  动物

6月龄的APP/PS1双转基因AD模型小鼠40只，同月龄的C57野生型小鼠10只，体质量27～32 g，购自河南省实验动物中心，许可证号SCXK（豫）2016—

1.3  仪器

Allegra X-30R低温离心机（美国Beckman公司）；iMark酶标仪（美国Bio-Rad公司）；MT-200 Morris水迷宫（成都泰盟科技公司）。

2  方法

2.1  分组与给药

10），分别为模型组及人参皂苷Rg₁低、中、高剂量（5、10、15 mg/kg）组。实验小鼠在适应1周后进行实验。人参皂苷Rg₁各剂量组通过ip给药方式连续给药20 d，给药体积10 mL/kg；对照组和模型组则同时给予相应剂量的生理盐水。

2.2  行为学实验

连续给药20 d后进行Morris水迷宫实验。每只小鼠连续训练4 d，每天训练2次，间隔30 min，每次训练60 s。训练过程中，若小鼠找到并爬到站台则让其停留15 s，若入水后1 min内未能找到或爬上站台，则将其引导至站台上站立15 s，之后将小鼠从站台上取下休息；实验过程中记录其在1 min内初次到达平台的时间。实验第5天则进行空间探索实验，去掉水中平台，记录小鼠在1 min内穿越平台的次数、目标象限停留时间。

2.3  氧化应激相关指标测定

行为学实验结束后，各组小鼠断头处死，快速然后测定脑组织匀浆中的SOD、GSH-Px、CAT活性与MDA水平，所有操作均按照试剂盒说明书进行。

2.4  细胞因子相关指标测定

行为学实验结束后，各组小鼠眼眶取血，离心取血清后保存，采用ELISA法测定血清中细胞因子TNF-α、IFN-γ、IL-1β、IL-2、IL-6水平，具体操作严格按照说明书进行。

2.5  海马组织HE染色观察和免疫荧光染色

行为学实验结束后，断头处死各组小鼠，快速取出脑组织。用10%福尔马林对脑组织进行固定；HE染色则是固定后经逐级乙醇脱水，二甲苯透明，石蜡包埋，制成厚3 μm的切片，进行常规的HE染色；免疫荧光染色则是采用Aβ抗体4 ℃孵育过夜，PBST洗涤3次后羊抗小鼠Alexa Fluor 555孵育2 h，采用PBST洗涤3次后封片；然后对各组小鼠脑组织切片进行显微镜观察、拍照。

2.6  凋亡相关蛋白的测定

称取适量的海马组织，采用液氮研磨，然后按照10∶1加入组织蛋白裂解液，再加入广谱的磷酸酶抑制剂（1∶100）和PMSF（1∶100），在冰浴上放置2 h，期间不断振荡，然后离心（4 ℃，3 500 r/min，10 min），取上清进行分装，并采用BCA法测定蛋白质量浓度。计算出相应的上样量，加入相

2.7  数据统计与分析

Western blotting实验结果采用Image Studio软件对目的蛋白条带进行灰度分析。采用Graph Pad Prism5.0软件进行数据统计分析，实验数据以表示，行为学数据采用双因素方差分析，Tukey检验；其余数据采用单因素方差分析。

3  结果

3.1  水迷宫实验结果

3.2  海马组织SOD、GSH-Px、CAT活性与MDA水平测定结果

3.3  血清细胞因子TNF-α、IFN-γ、IL-1β、IL-2和IL-6水平测定结果

图3结果显示，与对照组比较，模型组小鼠血＜0.05、0.01）；当给予人参皂苷Rg₁后，人参皂苷Rg₁中、高剂量组小鼠血清中的TNF-α、IFN-γ、IL-1β和IL-6水平显著性回调（P＜0.05、0.01）。此外，与对照组比较，模型组小鼠血清IL-2水平显著降低（P＜0.01），当给予人参皂苷Rg₁后，人参皂苷Rg₁中、高剂量组小鼠血清IL-2水平显著升高（P＜0.05）。

3.4  海马组织HE染色观察结果

与对照组比较，模型组小鼠海马神经元排列紊乱，海马CA1、CA3和DG区出现大面积的神经元坏死，胞质嗜酸性增强，细胞核固缩、溶解、消失。当给予人参皂苷Rg₁后，各给药组小鼠海马神经元的病理特征均有不同程度的改善，中、高剂量组最接近对照组。结果见图4。

3.5  脑组织中淀粉样蛋白斑块检测结果

用免疫荧光染色观察海马DG区Aβ蛋白的沉积水平，具体结果见图5，APP/PS1转基因小鼠脑内海马DG区出现大量的Aβ阳性神经元胞体和阳性斑块，当给予人参皂苷Rg₁后，APP/PS1转基因小鼠脑内Aβ斑块明显减少，其中高剂量组恢复到接近对照组水平。

3.6  海马组织Bcl-2、Bax、Cyt-c、Caspase-3和Caspase-9蛋白表达水平检测结果

与对照组比较，模型组小鼠海马组织的Bcl-2与Bax相对表达量比值（Bcl-2/Bax）显性降低，Cyt-c、Caspase-3和Caspase-9蛋白表达量显著升高，表明AD模型小鼠海马组织促凋亡相关蛋白表达量显著增加；当给予人参皂苷Rg₁后，人参皂苷Rg₁中、高剂量组小鼠海马组织的Bcl-2/Bax以及Cyt-c、Caspase-3和Caspase-9蛋白表达量均显著回调（P＜0.05、0.01），表明人参皂苷Rg₁具有抗凋亡、保护神经元的作用。结果见图6。

4  讨论

中枢突触是神经系统中细胞间信息传递和加工的基础环节，其功能活动和形态结构上的改变长期以来被认为是学习和记忆活动的神经生物学基础；而海马结构是最早被认为在学习记忆中起着关键作用的中枢结构^[18-19]。现代研究表明Aβ斑块是AD患者脑病理学的主要特征之一，Aβ在一定条件下具有神经毒性，聚集状态的Aβ则具有更强的神经毒性，能够诱导神经元凋亡，导致认知功能障碍。水迷宫实验是检测小鼠认知功能的常用实验^[20-22]；在本研究中，模型组小鼠的潜伏期显著延长，穿越平台次数和目标象限停留时间则显著降低，表明APP/PS1双转基因AD模型小鼠确实发生了认知功能障碍，这与文献报道一致^[23]；当长时间给予人参皂苷Rg₁（15、20 mg/kg）后，小鼠水迷宫实验中潜伏期则显著缩短，穿越平台次数和目标象限停留时间显著增加，表明人参皂苷Rg₁具有改善APP/PS1双转基因AD模型小鼠认知功能的作用。

众多研究表明，氧化应激参与AD的病理过程，能够导致神经元凋亡并加速AD的产生^[24-26]。神经元凋亡和缺失也是导致认知功能障碍的主要因素。此外，MDA是机体氧化应激状态的重要指标，而SOD、CAT和GSH-P_X则是机体清除自由基的关键酶，可以保护机体免受自由基的损伤。本研究发现模型组小鼠海马组织中的SOD、CAT和GSH-P_X活性显著降低，MDA含量显著升高，表明机体处于氧化应激状态；当给予一定量的人参皂苷Rg₁后，小鼠海马组织中SOD、CAT和GSH-P_X活性和MDA水平则显著回调，表明人参皂苷Rg₁具有显著的抗氧化活性。

此外，脑内Aβ沉积可激活先天免疫系统，导致小胶质细胞和星形胶质细胞激活，从而释放炎性细胞因子，进而加重神经退行性疾病^[27-28]；有研究发现长时间服用非甾体抗炎药对于早期的AD病程发展具有一定的改善作用，但是对于重度AD患者则无效果^[29-30]。TNF-α、IL-1β和IL-6的升高是诱发神经炎症、使得白细胞聚集到中枢神经系统的重要因素之一。这些反应可促进脑内Aβ沉积和星形胶质细胞与小胶质细胞的激活；而当Aβ与小胶质细胞表面结合时，又可加速促炎因子的表达，使得TNF-α、IL-1β和IL-6水平升高，从而导致tau蛋白过度磷酸化和神经元死亡^[31-34]。IL-2存在于海马神经元中，随着神经元细胞凋亡的加速可导致IL-2水平降低，机体免疫力下降；INI-γ则主要由淋巴细胞产生，INI-γ能够刺激星形胶质细胞活化，增加促炎因子TNF-α的释放，进而诱发或加重神经细胞的损伤。本研究发现AD模型小鼠血清中TNF-α、IL-1β、IL-6和INI-γ水平显著升高，IL-2水平显著降低；当给予人参皂苷Rg₁后，TNF-α、IL-1β、IL-6、INI-γ和IL-2水平均显著回调，表明人参皂苷Rg₁具有抗炎和神经保护作用。

神经细胞凋亡也是AD发生的一个重要机制；海马组织的HE染色和Nissl染色结果显示APP/PS1双转基因AD模型小鼠神经元细胞大面积凋亡、坏死^[35-36]；当给予人参皂苷Rg₁后，其海马组织神经元凋亡明显减少，其中高剂量组并有恢复到对照组水平的趋势，表明人参皂苷Rg₁具有神经保护作用。为了进一步评价APP/PS1双转基因AD模型小鼠神经元凋亡与人参皂苷Rg₁的神经保护作用，本研究测定了凋亡相关蛋白。Bcl-2是一种抗凋亡蛋白，Bax则是一种促凋亡蛋白。Bcl-2/Bax决定了细胞是否发生凋亡。APP/PS1双转基因AD模型小鼠海马组织Bcl-2/Bax明显降低，Cyt-c、Caspase-3和Caspase-9水平则显著升高，表明AD疾病的发作能够促进小鼠海马神经元凋亡。当给予人参皂苷Rg₁后，其Bcl-2/Bax，Cyt-c、Caspase-3和Caspase-9蛋白表达水平均显著回调，表明人参皂苷Rg₁主要是通过调节凋亡相关蛋白来发挥神经保护作用。

综上所述，人参皂苷Rg₁能够改善APP/PS1双转基因AD模型小鼠的AD模型小鼠的认知功能障碍，其主要的机制可能是通过改善氧化应激，减轻炎症反应，抑制凋亡相关蛋白表达而抑制神经元凋亡来发挥改善认知的作用。

参考文献（略） 

来  源：  刘  琳，张  凯，何  勐，刘  威. 人参皂苷Rg1对阿尔茨海默病转基因小鼠的神经保护作用 [J]. 中草药, 2020, 51（5）: 1264-1272.