聚合酶链式反应 (PCR) 是分子生物学领域功能最强大的技术之一。实时荧光定量PCR 是在标准 PCR 技术基础上演变而成，常用于定量样本中的 DNA 或RNA。
利用荧光探针或荧光 DNA 结合染料，采用实时荧光定量PCR 仪检测荧光并完成 PCR 反应所需的热循环，实现扩增产物的定量。利用序列特异性引物，可测定特定的 DNA 或 RNA 序列的拷贝数。通过检测 PCR 循环的每个阶段中扩增产物的量，实现定量。如果样本中存在高丰度的特定序列 (DNA 或 RNA)，则在早期循环中即可观察到扩增；如果序列较少，则在晚期循环中方可观察到扩增。
实时荧光定量 PCR 分析的部分实施需要经过优化以确保所有反应参数均设置精确，从而获得准确的结果，常见困难可归结为六个主要方面，今天重点介绍前三种：
一、引物二聚体的形成
1、引物二聚体形成的原因
引物二聚体的形成是在实时荧光定量 PCR 设计和验证过程中最常见的问题之一，当引物对之间的部分序列存在同源性时，可形成引物二聚体。如果在 PCR 反应过程中引物退火形成二聚体，则 TaqDNA 聚合酶可延伸二聚体，形成长于原始引物的产物，它可导致循环过程中更易出现退火错误。根据长度的不同，引物也可能出现自身折叠，由此与模板形成冲突。反应的复杂性 (尤其在多重反应过程中) 可使上述不良影响发生的几率增加。
2、如何确定是否存在引物二聚体？
凝胶电泳是显示引物二聚体的一种极佳的方法。如图 1所示，引物二聚体在凝胶的底部形成扩散条带，通常位100 bp 以下。在 PCR 过程中，二聚体的形成与模板的退火及延伸之间存在竞争作用。引物二聚体通常随模板的减少而增加。单独采用凝胶电泳分析进行验证的缺点在于，其灵敏度最低仅达到纳克级，因此可能无法得出结果。凝胶电泳分析的优势是当解离曲线 (熔解曲线) 数据同时可用时，产物的大小有助于对结果进行综合解释。
解离曲线，又称熔解曲线，是利用双链 DNA 结合染料获得的标准反应热廊线。如果扩增具有极好的特异性，则实时荧光定量 PCR 板上每个反应孔的解离曲线将出现一个较窄的单峰。引物二聚体的荧光强度较低，呈较宽的“波形”，显示其在 70°C 左右熔解。出现此峰形和熔解温度主要是由于引物二聚体的长度较小且不确定。若对解离曲线中是否存在引物二聚体有任何疑问，可将观察的结果与 NTC（No Template Control，即无模板对照，是阴性对照）反应孔相比较，当模板不存在时，更易出现引物二聚体峰 (图 2，熔解曲线中突出显示了特异性扩增 (图2A) 和引物二聚体效应(图2B)。可利用 NTC 样本在熔解曲线中产生多余的峰(图2B) 识别出引物二聚体)。
3、如何减少或去除引物二聚体？
如果出现了引物二聚体，有许多方法可以减少或消除反应中的引物二聚体。
（1） 首先是优化热循环条件，这主要是提高退火温度。大多数情况下，两步循环 (由 95°C 变性步骤直接进入60°C 退火和延伸步骤) 有利于强效扩增，因此引物设计时设定的成功退火温度为 60°C。
（2）可降低引物浓度，甚至采用不同的正向引物和反向引物的比值也有一定的帮助。大多数情况下，每条引物的理想最终浓度为 200 nM，但如有需要，可将浓度降至 60 nM。
（3）镁的最佳浓度一般约为 3 mM。高于此浓度易形成引物二聚体。
（4）如果未对引物形成二聚体的倾向进行评估，则应补充评估并考虑重新设计 (如有需要)。通常情况下，最好使用热启动 DNA 聚合酶，并在冰上进行反应。
（5）在理论上，针对同一靶点应同时检测多个引物组。这实际上可以节省大量时间，因为如果这些引物中的一个能立即发挥作用，则可以减少花费在优化过程上的时间。
二、引物和探针的储存
1、引物和探针的储存
尽管引物和探针的储存经常被忽略，但其在保证实时荧光定量 PCR 分析的长期成功和一致性方面具有重要作用。影响引物和探针的稳定性的主要因素是储存温度、储存时间、是否被长时间暴光、储存的引物和探针的浓度以及储存溶液的组分。图3扩增曲线分别显示了储存不当的引物 (A) 与储存适当的引物 (B) 产生的效果。
图3
2、长期保持引物和探针的稳定性保持引物和探针的稳定性的关键有四点：
（1）低压冻干的引物在储存时间和温度方面具有更好的灵活性。引物一旦重新溶解，即应置于 -20°C 保存，且若保存时间超过一年则应对其进行监测，看它是否出现功能下降。
（2）对于标记的引物和探针，则应采取措施避免标记物暴光 (例如使用不透明管及置于暗处保存)，以延长它们的使用寿命。
（3）引物浓度也可影响其稳定性。建议引物的储存浓度不低于10 μM；实际上，在大多数情况下，100 μM 的引物浓度操作更简单。引物和探针还应分装保存，以减少冻融次数，特别是标记的引物和探针。
（4）最后，TE 缓冲液可形成比水更为稳定的环境。此外，含有 0.1 mM EDTA的 TE 缓冲液 (标准 TE 中含有 1 mM EDTA) 是一种理想的溶液，这是由于一些 PCR 反应对 EDTA 的灵敏度可能有一些残存。
三、NTC 扩增
如前所述，当引物二聚体形成时，如果使用与 DNA 双链结合的染料，在 NTC 反应中也可观察到荧光信号。无论是基于探针还是双链 DNA 结合染料的反应，在存在污染物的情况下，也可看到晚期扩增。见图4，A是扩增曲线B是溶解曲线。
如果在每一个 NTC 反应里都出现扩增，很可能是其中一种或两种试剂被污染了。可采用以下步骤防止或去除污染。
（1）使用干净的工作台，用带核酸降解试剂的的溶液擦抹工作台面。
（2） 用带 dUTP 和 UDG 的反应预混液降解来自前序 PCR反应的产物，防止前序 PCR 反应的污染。
（3） 用新的反应管通过置换不同来源的试剂，发现出现问题的试剂。
（4） 在条件允许的情况下，在不同的实验地点建立反应，尤其是当应用质粒作为对照时 (质粒可以被很容易扩散并且难以去掉)。
图4
优化实时荧光定量 PCR 反应过程需要花费一定的时间，但是所花的时间是值得的。这样得出的分析结果不仅具有最高的灵敏度和最大的动态范围，而且效率高，重复性好。这些因素使数据具有可靠性，并最终为研究界所接受。
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在过去的数年中，实时荧光定量PCR 已成为DNA 或RNA检测和定量的主要工具，所以，了解并解决实时荧光定量PCR实验中的常见问题能使我们的结果更可靠，上期给大家总结了三种疑难问题（点击进入），今天，将继续介绍后三种疑难问题：
四、实时荧光定量 PCR 的抑制和较低的反应效率
在这一点上，应将反应效率视为实时荧光定量PCR 分析设计和优化的关键因素。利用标准曲线(通过对目标模板进行连续梯度稀释获得) 获取效率值。该效率值可作为总反应的“健康”标志。低效率与高效率所造成的影响有所不同。改善上述两种情形的步骤则相差甚远。理想的反应效率为100%，但反应效率在90–110% 范围内都是可以接受的。
导致效率较高或较低的原因：效率高于110% 说明反应过程中存在抑制作用。引起抑制作用的原因包括RNA 或DNA 质量较差，模板浓度过高及含有核酸纯化的残余物。反应效率较低比抑制作用更常见，它是指效率低于90%。其原因包括试剂浓度不适(主要是引物、镁和Taq DNA 聚合酶，尤其是在多重实验中)。造成反应效率较低的其它因素包括引物T m 之间的差异超过5°C 以及热循环条件不适。效率偏差引发的问题效率超出90–110% 的范围可对结果造成人为影响，易导致假结论，这主要是由于作为对照的靶序列的效率不同。
此外，抑制作用和较低的效率可影响分析的灵敏度，并导致动态范围减小及通用性降低。图5显示了不同的扩增效率引起的偏差效应。四种不同的实时荧光定量PCR 反应的效率在70% 至100% 之间。其差异在早期循环并不明显。但在30 个循环之后，效率为70% 的反应与效率为100% 的反应之间报告的拷贝数差异达100 倍。反应的循环数越多，分析要求的灵敏度越高，效率差异就显得越重要。图6，连续梯度稀释模板，评估反应效率。Ct 较小的稀释度呈扁平状且扩增曲线形状异常。随着模板逐渐被稀释，抑制作用消失，曲线也呈现更明显的特征性指数期的形状。
图5
图6
1、如何确定是否存在效率偏差现象？
确定某个特定的分析效率是否低下的最佳方法是稀释模板生成标准曲线(模板稀释的范围应涵盖所有未知样本)，然后查看该范围内的效率。它应尽可能接近100%。熔解曲线出现多个峰或凝胶显示多种产物意味着反应源物质之间存在竞争作用，这必将对反应效率产生影响。
2、如何解决低效率或抑制作用？
一旦确定反应被抑制或效率较低，则可采取一些步骤将效率值重新调整到理想范围内。
（1）对于抑制作用，可去除模板浓度最高的反应孔并重新分析标准曲线。如果效率重新回到110% 以下，则分析良好。
（2）另一种解决方案是重新纯化模板。切记应延长干燥时间，以去除乙醇沉淀过程中的乙醇，或采用另外的柱上洗涤液将离液盐从硅胶纯化物中去除。
（3）通过分析优化可解决效率低下的问题。此过程有时相对简单，但在某些情况下，随着分析复杂度的提高，优化过程可能十分耗时费力。
（4）扩增单个产物时，将镁的浓度提升至6mM 可提高反应效率，但当出现竞争作用时，则应降低镁的浓度。
（5）在某些情况下(主要是多重反应中)，必须采用引物和探针优化基质。此时，需检测正向引物与反向引物的比值或浓度，有时甚至还需检测探针比值，以找出分析的理想浓度组合。最佳引物浓度介于100至600nM之间，而最佳探针浓度则在100nM至400nM 之间。
（6）根据引物的Tm 值，确保热循环条件(尤其是退火温度)适当，且引物设计时使之有相似的Tm 值。
五、软件分析设置
如前所述，仪器分析有时会破坏一个成功的分析。对数据准确性影响最大的分析设置包括：扩增曲线基线线性度、基线范围设置、阈值、参考染料
图7
1、扩增曲线基线线性度
扩增曲线基线线性度是影响结果的参数之一。仪器软件通常能够在曲线的平滑部分自动设置基线。但当Ct值出现过早时(例如使用18S 作为标准品)，其设置的基线错误地包括了非平直区域。图8显示了同一曲线的不同基线设置。图8A 显示的曲线的基线范围包括第1至第14个循环，由于在第10个循环中即可检测出荧光，因此基线设置范围过宽,其结果是造成曲线下降和Ct 延迟。图8B显示基线被重新设置在第2至第8个循环的线性范围内，使曲线和Ct回到准确的位置上。
图8
2、基线范围设置
基线：一般来讲，第3-15个循环的荧光值就是基线。基线范围设置常被忽略，但它也可对反应效率产生影响。如图9所示，仪器默认设置通常在分析的可取范围内。但是，手动调整有时可进一步改善结果。图9比较不同的基线设置方法，达到可接受的反应效率。(A 和D) 这些曲线中基线的手动设置范围很宽，标准曲线的斜率较低，仅为–2.81，其值不在–3.58 至–3.10 (对应于90–110% 的效率) 的最佳范围之内；(C 和F) 我们可以看到与图A 和D 相同的曲线，但其基线是由仪器自动选择的。现在的斜率在最佳窗口范围内，且分析也在动态范围内；(B 和E) 这些曲线为手动调整获得的，在基线内另外加入了4 至5 个循环，其斜率得到进一步改进，效率更加接近于100%。
图9
3、阈值
阈值(超过背景值的荧光强度，用来确定Ct值) 是另一个由软件自动设置的参数，但也可手动调整(图10)。在对同一程序中的多种试剂盒或化学试剂进行评估时，经常可出现上述情况。软件将自动选择阈值，此阈值更适合平台更高的曲线(图10中的蓝色曲线)。这将导致此数据组中的红色曲线的Ct值出现偏差，因为其最佳阈值比此值更低。因此，需对每个数据组进行独立研究，这样才能根据具体情形选择最佳阈值。
图10
4、参考染料
通常，可以将极高和极低的模板包括在检测极限范围内，因为如果效率受到影响，则可将终末数据点去除。采用诸如ROX 和荧光素等参考染料能够很好地避免因仪器和用户所造成的错误。这些错误十分常见，以至于这个“幕后”因素经常被人们遗忘，其对反应的负面影响也被忽略了。但是，了解仪器软件与染料本身之间的关系是十分重要的。对于采用参考染料的仪器来说，其软件将惰性染料的荧光信号从靶序列发出的荧光中删除。因此，如果ROX™的强度过高，可导致目标信号返回效果极差，扩增曲线呈锯齿状且不连续(图11A)。表面上似乎是反应失败了，需要采取大量的优化措施，但从何处开始呢？如果关闭ROX™通道并重新分析标准品和数据，则可发现数据实际上是好的(图11B)；这是参考染料标准化的问题。
图11
六、无扩增（无Ct值出现）或Ct值出现过晚（Ct＞38）
Ct值：Ct值就是荧光值达到阈值时候的PCR循环次数，跟初始模板的量成反比，见图12。
图12
对于无扩增现象，一旦确认上述问题都有被一一确认，那么其他可能带来无扩增的原因包括：
1、低表达问题
通常基因表达检测所需的cDNA 量为1 到100 ng。但是如果您的目的基因的丰量的样本中很低，可能就需要更多的样本量。检测一个样本量的范围，或者更理想的情况下加入阳性对照反应确认反应本身正常。如果您对期望的表达水平不是很确定，可重新查询文献或NCBI Unigene 数据库中EST 表达数据来预估在不同组织中的表达水平。
2、逆转录的问题
与低表达量相关，如果您感兴趣的基因在样本中的丰度很低，您需要增加实验的灵敏度。确认一下您的qPCR 反应中没有加入过量的cDNA (最大加样水平为20% v/v)，因为过量的cDNA 样本会引入抑制剂降低反应效率。您也可以检查一下逆转录酶和引物。随机引物通常比基于oligo(dT)的方法产生更多的cDNA。另外，有些酶，例如Super- ® III 逆转录酶经过热稳定性改造，也会提高cDNA产量。检查您的反应中的各组分，通过优化各组分提高扩增效率。
3、实验问题
如果没有见到任何扩增，可能是引物/探针的设计并未针对正确的靶点。检查序列数据库如NCBI 搜寻目的基因的不同变异型。有可能实验设计知识针对了其中一种变异体，但是在所研究的样本里并无表达。同时还要检查引物/探针靶向的目的基因的区域，是在编码区还是内含子？靶向5’UTR 区域是不会检查到转染到细胞里的外源基因表达的(因为5’UTR 区域是不会包含在表达载体质粒上的)。类似的情况，如果实验设计是靶向内含子序列的，也是不会从cDNA 样本中得到扩增的。
总 结
疑难解析是验证和采用实时荧光定量PCR 分析时必不可少的内容。但是，通过对关键问题进行分类并加以理解，该过程可变得相对容易。
·确保引物二聚体不会产生信号或造成反应效率低下
·采取必要的步骤维持引物和探针的稳定性
·反应评估过程的最后一步是对标准曲线进行验证
·了解效率低于90% 时采用的处理方法与该值高于110% 的处理方法不同
·验证并调整仪器分析设置(如有需要)
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