5’-race接头序列添加方法及接头序列和5’端未知基因完整编码序列的扩增方法

锚定引物5’-race接头序列添加方法及接头序列和5’端未知基因完整编码序列的扩增方法

技术领域：
本发明涉及一种接头序列添加方法及接头序列和基因完整编码序列的扩增方法。
背景技术：
若要克隆编码区仅3’端一侧的序列已知的基因，需要先获得5’端一侧的未知序 列，进而获得完整的编码序列。如今，RACE技术是根据基因已知的部分序列扩增未知片段 的最佳方法。RACE技术(rapid amplification of cDNA ends, RACE)概括地说就是通过 逆转录和PCR的有机结合，扩增基因未知片段的技术。利用基因编码区3’端的已知序列， 获得5’端未知序列的技术称为5’ -RACE，是如今扩增5’端未知基因完整编码序列的最常 用技术。5’ -RACE基本原理首先获得包含目的基因mRNA的RNA样品，并利用基因特异的 引物进行逆转录，获得目的基因相应的cDNA ；在cDNA的3’末端(对应mRNA序列5’末端) 加上特定的序列，通常将这段添加在cDNA上的特定序列称为接头(adaptor)，同时合成与 adaptor序列相匹配的引物，称为锚定引物；然后利用基因已知序列设计基因特异性引物， 与锚定引物配对进行PCR扩增，得到未知部分的片段；再将扩增得到的片段测序，即可获得 目的基因未知部分的序列。目前按接头序列的添加方法可分为3大类末端转移酶法 (terminaldeoxynucleotidyl transferase method, TdT method)、接头连接法(adaptor ligation)和寡核苷酸帽法(oligo caping method)。近年出现了一些可同时扩增编码区3’ 一侧与5’ 一侧未知片段的技术，并推出了相应的试剂盒，如GeneRacer (Invitrogen公司)、 SMART RACE(Takara-BD公司)等。这些技术的基本原理是用oligo (dT)起始逆转录，在完 整mRNA逆转录所得的完整cDNA产物的3’端及5’端分别添加3’-adaptor及5’-adaptor， 使所有完整的cDNA在两端都带有adaptor，成为包含所有基因信息的通用模板。再利用目 的基因的特异引物与某一端的锚定引物搭配，则可利用同一份通用模板获得不同基因、不 同末端的未知序列。采用末端转移酶法和接头连接法存在一个共同的问题，就是会在逆转录所得的所 有cDNA的3’末端都加上adaptor，无法区分5’端完整与不完整的mRNA，也无法区分逆转录 进行得完全与不完全的cDNA，因此不能保证mRNA5’末端信息的完整。这样，若要获得基因 编码区完整5’末端的信息，往往需要进行不只一次的“逆转录-添加adaptor-PCR-测序” 过程，每次需根据上一次测序所得的序列设计新的逆转录引物，也就是需要进行多轮RACE。 此外，这两种方法都需要先将逆转录产物进行纯化，才能添加adaptor，而cDNA在纯化过程 中会发生损失，因此需要制备较大量的cDNA。虽然寡核苷酸帽法可以选择性地对5’端完整的mRNA进行扩增，解决了末端转移 酶法和接头连接法对mRNA完整性无选择性的问题。但寡核苷酸帽法存在需要对RNA进行 多步操作，在各步的酶反应之间又都需要对RNA进行纯化，而且RNA很容易被降解，因此很
3容易损失掉大量的RNA，从而降低了此后RACE工作的效率，对于丰度较低的mRNA，甚至很难 得到扩增产物。利用通用模板作为起始材料，虽然可高通量地进行基因克隆，但是若仅需要通过 5’-RACE扩增少数5’端未知基因编码区的未知片段，通用模板并不适合。原因有如下2点首先，通用模板的复杂性很高。通用模板对基因没有选择性，所有基因的完整cDNA 均添加有adaptor，理论上包含所有基因对应的cDNA。在复杂的模板中，目的基因cDNA含 量相对较低，对于表达丰度较低的基因，克隆难度则更大。而且，模板越复杂，PCR反应中越 容易发生非特异扩增，影响目的片段在PCR反应中的扩增效率，非特异的扩增产物还会干 扰目的条带的选择。其次，通用模板制备过程中，信息损失的可能性较大。这是因为，通用模板对RNA 以及逆转录反应的完整性要求都很高，不完整mRNA的逆转录产物以及逆转录反应中链延 伸不完全的cDNA都不会被添加adaptor ；而逆转录反应的链延伸过程又很容易发生未成熟 终止，若待延伸的mRNA模板较长，或具有较复杂的二级结构，则未成熟终止的可能性较大。 制备通用模板时逆转录反应需要从mRNA的3’末端一直延伸到5’末端，对于编码区较长的 基因，很难得到基因的完整cDNA。这些都会增加5’ -RACE的工作量，并可能影响5’ -RACE 结果。此外，现有的所有5’ -RACE方法中引物的设计和使用都受到强烈的限制。末端转 移酶法只能添加一串相同的核苷酸，通用模板只能使用同一套adaptor，接头连接法和寡核 苷酸帽法中的adaptor虽然可以自行设计，但由于链的长度影响连接反应的效率，因此也 只能添加长度有限的adaptor ( 一般为15 30bp)。这样就无法使用最适合于目的物种、目 的基因的adaptor和相应的锚定引物，甚至模板中的部分基因序列中很可能含有锚定引物 的非特异性结合位点。在PCR扩增时需要将锚定引物与基因特异引物搭配，研究人员就必 须根据锚定引物的特点设计基因特异引物，这样就会缩小基因特异引物的选择范围，最适 合于目的基因的引物往往无法直接用于扩增。引物设计的灵活性有限，就使得研究人员需 要花费较大工作量探讨PCR条件，影响基因克隆效率。

发明内容
本发明的目的是为了解决现有接头序列添加方法存在的对mRNA 5’末端信息的 完整性没有选择性；对目的基因针对性差；逆转录反应不充分；接头序列设计不灵活；成 本高，操作不简便；以及现有5’端未知基因完整编码序列的扩增方法中接头序列及锚定 引物的设计不灵活；成本高，操作不简便；未知片段的克隆效率低等缺陷；而提供了一种 5’ -RACE接头序列添加方法及接头序列和5’端未知基因完整编码序列的扩增方法。本发明5’ -RACE接头序列按以下步骤添加一、根据目的基因设计目的基因特异性逆转录引物，根据目的基因所在物种基因 组特征设计接头序列，接头序列的3’末端设计有至少3个连续的鸟嘌呤；二、在逆转录体系中加入接头和目的基因特异性逆转录引物，然后用有末端转移 酶活性的逆转录酶进行逆转录，实现了 5’ -RACE接头序列添加。5’ -RACE接头序列添加方法原理如图1所示，当逆转录的链延伸反应进行到mRNA 的5’末端的帽子结构时会在所合成的cDNA末端连续加上若干个dC( —般为2 4个胞嘧啶)；由于在逆转录体系中事先加入3’端带有oligo(dG)的接头序列作为模板转换引物，所 以当逆转录即将完成时，接头序列3’端的oligo(dG)会与cDNA末端的dC配对，有末端转 移酶活性的逆转录酶则发生模板转换，以接头序列为模板继续进行链延伸，从而得到3’端 添加了接头的单链cDNA片段，实现了 5’ -RACE接头序列添加。本发明5’ -RACE接头序列添加方法具有以下优点1.对mRNA 5’末端信息的完整性有选择性。排除了信息不完整的片段对克隆过程 的干扰。2、使用目的基因特异性逆转录引物起始逆转录，对目的基因有针对性。起始模板 复杂度低，排除了无关基因的干扰。3、逆转录反应充分。有效地避免率逆转录反应链延伸时发生未成熟终止。4,adaptor的设计灵活。能够设计较长的接头序列，可设计长度大于40bp的接头 序列，以增强adaptor的特异性。5.成本低，操作简便。本发明方法操作步骤少，后续的PCR特异性和扩增效率高， 且使用实验室常用试剂和设备即可完成。6、本发明方法由逆转录酶自动完成接头序列的添加。本发明接头序列为适用于野生大豆(Glycine soja)的5’ -RACE接头序列，该 5，-RACE 接头序列为 5，-ATAGCAGTGTGATACCATGAGACGGGCACATTACGGCTCGGGG-3，。本发明5’端未知基因完整编码序列按以下步骤进行扩增一、根据目的基因及目的物种设计目的基因特异性逆转录引物、目的基因特异性 巢式PCR引物以及接头序列，并根据接头序列设计巢式锚定引物，接头序列的3’末端设计 有至少3个连续的鸟嘌呤；二、在逆转录体系中加入接头和目的基因特异性逆转录引物，然后用有末端转移 酶活性的逆转录酶进行逆转录，获得3’端添加了接头序列的单链cDNA片段；三、以3’端添加了接头的单链cDNA片段为模板，用目的基因特异性巢式PCR引物 和巢式锚定引物进行巢式PCR扩增；四、对步骤三获得的巢式PCR扩增片段进行测序，再利用软件分析，获得目的基因 3’末端至5’末端的序列，验证后即得到5’端未知目的基因的完整编码序列；其中步骤一 所设计的巢式锚定引物在目的基因所在的物种基因组或cDNA中无可见非特异扩增产物。本发明5’端未知基因完整编码序列的扩增方法具有以下优点1、对mRNA 5’末端信息的完整性有选择性。只有充分延伸到mRNA 5’端的cDNA 才能被添加接头序列并在PCR反应中得到扩增，排除了信息不完整的片段对克隆过程的干 扰，只通过一轮RACE便可获得包含目的基因编码区5’末端完整信息的序列。2、使用目的基因特异性逆转录引物起始逆转录，对目的基因有针对性。其它基因 的mRNA理论上不会发生逆转录反应，因此逆转录产物中以目的基因对应的cDNA为主，起始 模板复杂度低，可排除无关基因的干扰，提高RACE中PCR反应的特异性和效率。3、逆转录反应充分。目的基因特异性逆转录引物靠近mRNA的5’端，使逆转录反 应的链延伸长度缩短，降低了逆转录反应链延伸时发生未成熟终止的风险，有利于使逆转 录反应充分延伸至mRNA 5’末端；而且在逆转录反应中，由于其它基因的mRNA不会发生逆 转录反应，因此还可保证目的基因mRNA的逆转录效率，使目的基因的完整mRNA都能被完整地逆转录成cDNA并添加上adaptor。4、adaptor及引物的设计灵活。本发明方法针对不同的物种，可设计不同的锚定 引物，使锚定引物在该物种基因组或cDNA中发生非特异扩增的可能性大幅降低。对于不同 的基因，可以使用不同的锚定引物，使锚定引物能与最佳的巢式PCR扩增引物搭配。由于 adaptor以逆转录模板的形式引入，因此不涉及连接反应，因此对adaptor的长度限制也比 较宽松，可设计较长的adaptor，从而设计出较多条与之配对的巢式锚定引物，以便引物筛 选和PCR条件探讨。5.成本低，操作简便。本发明方法操作步骤少，PCR特异性和扩增效率高，且使用 实验室常用试剂和设备即可完成，且不需要对RNA或cDNA进行纯化等操作，可避免多步骤 操作引起的样品损失。6.未知片段的克隆效率高。本发明方法通过一轮RACE、几个简单的步骤操作和少 数几次PCR反应，即可完成5’端未知序列的扩增，获得完整的编码区5’端序列信息。本发 明方法特别适用于单个基因5’ 一侧未知片段的扩增，整体的克隆效率均高于现有5’端未 知基因完整编码序列扩增方法。由于模板对基因有针对性，且引物的设计搭配灵活，因此 PCR条件也比较容易探讨；而且扩增产物包括目的基因编码区5’端的完整信息，不需要重 复进行RACE过程。7、本发明方法主要过程由逆转录酶自动完成，不需要纯化等操作，接头序列的添 加直接发生在逆转录反应之后的同一体系中。


图1是本发明5’ -RACE接头序列添加方法原理图。图2是具体实施方式
十八中 目的基因已知部分序列Blast X分析结果图。图3是具体实施方式
十八中第一轮PCR扩增 结果图，图3中“M”泳道标样为Marker, ‘T泳道标样为以GSP-1和API为引物的PCR扩 增产物，“2”泳道标样为以GSP-1为引物的PCR扩增产物，“3”泳道标样为以API为引物的 PCR扩增产物。图4是具体实施方式
十八中第二轮PCR扩增结果图，图4中“M”泳道标样为 Marker，“1”泳道标样为以GSP-2和AP2为引物的PCR扩增产物，“2”泳道标样为以GSP-2 为引物的PCR扩增产物，“3”泳道标样为以AP2为引物的PCR扩增产物。图5是具体实施方 式十八中第三轮PCR扩增结果图，图5中“M”泳道标样为Marker，“1”泳道标样为以GSP-3 和AP3为引物的PCR扩增产物，“ 2 ”泳道标样为以GSP-3为引物的PCR扩增产物，“ 3 ”泳道标 样为以AP3为引物的PCR扩增产物。图6是具体实施方式
十八巢式PCR中750bp 1000bp 之间的清晰条带与已有EST(PTE-234)拼接，并通过BlastX分析拼接结果图。图7是具体 实施方式十八中目的基因全长验证引物PCR结果图，图7中“M”泳道标样为Marker，“l”泳 道标样为总cDNA，“2”泳道标样为水。图8是具体实施方式
十八验证试验中最终所得基因 序列的0RF预测结果图。
具体实施例方式本发明技术方案不局限于以下所列举具体实施方式
，还包括各具体实施方式
间的 任意组合。
具体实施方式
一本实施方式5’ -RACE接头序列按以下步骤添加
一、根据目的基因设计目的基因特异性逆转录引物，根据目的基因所在物种基因 组特征设计接头序列，接头序列的3’末端设计有至少3个连续的鸟嘌呤；二、在逆转录体系中加入接头和目的基因特异性逆转录引物，然后用有末端转移 酶活性的逆转录酶进行逆转录，实现了 5’ -RACE接头序列添加。本实施方式在完成逆转录的同时实现了 5’ -RACE接头序列的添加。本实施方式方法可获得了 3’端添加了接头的单链cDNA片段。
具体实施方式
二 本实施方式与具体实施方式
一的不同点是步骤一所设计的目 的基因特异性逆转录引物与mRNA的结合位点与该目的基因CDNA3’端接近。其它步骤及参 数与实施方式一相同。目的基因特异性逆转录引物与mRNA的结合位点越靠近mRNA的5’端(即目的基 因CDNA3’端)，可使逆转录反应的链延伸长度缩短，降低了逆转录反应未成熟终止的风险， 有利于使逆转录反应充分延伸至mRNA的5’末端。
具体实施方式
三本实施方式与具体实施方式
一的不同点是步骤一所设计的 目的基因特异性逆转录引物与mRNA的结合位点与该目的基因CDNA3’端的距离为30 200bp。其它步骤及参数与实施方式一相同。
具体实施方式
四本实施方式与具体实施方式
一的不同点是步骤一所设计的目 的基因特异性逆转录引物与mRNA的结合位点与该目的基因CDNA3’端的距离为30。其它步 骤及参数与实施方式一相同。
具体实施方式
五本实施方式与具体实施方式
一至四之一的不同点是步骤一所 设计的接头序列的3’末端设计有3个、4个、5个、6个、7个或8个连续的鸟嘌呤。其它步 骤及参数与实施方式一至四之一相同。
具体实施方式
六本实施方式5’端未知基因完整编码序列按以下步骤进行扩增一、根据目的基因及目的物种设计目的基因特异性逆转录引物、目的基因特异性 巢式PCR引物以及接头序列，并根据接头序列设计巢式锚定引物，接头序列的3’末端设计 有至少3个连续的鸟嘌呤；二、在逆转录体系中加入接头和目的基因特异性逆转录引物，然后用有末端转移 酶活性的逆转录酶进行逆转录，获得3’端添加了接头序列的单链cDNA片段；三、以3’端添加了接头的单链cDNA片段为模板，用目的基因特异性巢式PCR引物 和巢式锚定引物进行巢式PCR扩增；四、对步骤三获得的巢式PCR扩增片段进行测序，再利用软件分析，获得目的基因 3’末端至5’末端的序列，验证后即得到5’端未知目的基因的完整编码序列；其中步骤一 所设计的巢式锚定引物在目的基因所在的物种基因组或cDNA中无可见非特异扩增产物。本实施方式目的基因特异性巢式PCR引物数量可为若干条，优选范围为2 4条。本实施方式中巢式锚定引物与目的基因特异性巢式PCR引物的Tm值应比较接近， 巢式锚定引物和目的基因特异性巢式PCR引物相互间Tm值之差应小于1°C ；而且巢式锚定 引物和目的基因特异性巢式PCR引物的长度及G/C含量等特征应相似。本实施方式步骤一中目的基因特异性逆转录引物、目的基因特异性巢式PCR引 物、接头序列和巢式锚定引物序列可自由设计。可针对不同的物种设计其特有的相应引物。 可先设计接头序列，再据其设计巢式锚定引物；也可先设计多条巢式锚定引物，最后将锚定引物序列整合在一起，设计1条含有各条锚定引物的结合位点的接头序列。由于接头序列 是通过模板转换机制添加的，并不直接参与酶反应，因此对其长度没有严格限制，若想设计 较多的巢式锚定引物，可增加接头序列的长度。设计完成的巢式锚定引物及接头序列可以 应用于同种生物其它基因的5’ -RACE。本实施方式方法针对不同物种可使用不同的接头序列和巢式锚定引物，选择在该物种基因组或cDNA中无可见非特异扩增产物的巢式锚定引物；针对不同的基因，可根据所 选择目的基因特异性逆转录引物和目的基因特异性巢式PCR引物设计接头序列和巢式锚 定引物，便于使用更佳的PCR条件。由于接头序列以逆转录模板的形式引入，因此不涉及连 接反应，因此对接头片段的长度限制也比较宽松，可设计较长的接头序列，及较多条与之配 对的巢式锚定引物，以便引物的筛选和PCR条件探讨。本实施方式方法在逆转录过程中直接在充分延伸的cDNA 3’末端添加接头序列， 因此对cDNA的完整性具有了选择性，只有当目的基因的mRNA 5’末端完整，且逆转录反应 延伸完全时所获得的cDNA才会被添加接头序列。再用根据接头序列设计的巢式锚定引物 与目的基因特异性巢式PCR引物搭配进行PCR，其中只有添加了接头序列的cDNA才能被扩 增。通过巢式或半巢式PCR进行扩增，排除了非特异扩增产物的干扰，可获得目的基因未知 cDNA 5，端部分片段。本实施方式方法步骤二逆转录反应的链延伸时间长，延伸温度要在酶所能承受的 范围之内尽量高，可以有利于打开mRNA的二级结构，使cDNA链得到顺利的延伸。本实施方式步骤四可采用BlastX等程序对序列进行分析。
具体实施方式
七本实施方式与具体实施方式
六的不同点是步骤一所设计的目 的基因特异性逆转录引物与RNA的结合位点与该目的基因mRNA的5’端接近；且步骤一所 设计的目的基因特异性的巢式PCR引物与cDNA的结合位点与该目的基因CDNA3’端接近。 其它步骤及参数与实施方式六相同。本实施方式中设计的目的基因特异性的巢式PCR引物应能与巢式锚定引物良好 搭配。本实施方式目的基因特异性逆转录引物与mRNA的结合位点越靠近mRNA的5’端 (即目的基因CDNA3’端)，可使逆转录反应的链延伸长度缩短，降低了逆转录反应未成熟终 止的风险，有利于使逆转录反应充分延伸至mRNA的5’末端。在设计目的基因特异性逆转录引物时，就使其结合位点与未知部分尽量接近，只 留下目的基因巢式PCR引物的结合位点，以及足够后续的序列拼接所需的一段已知序列即 可。这样可将目的基因特异性逆转录引物在逆转录反应中待延伸的长度尽量缩短，提高逆 转录反应链延伸充分的可能性。另外，由于基因特异的逆转录引物理论上只与目的基因的 mRNA结合并延伸，因此使逆转录产物中以目的基因对应的cDNA为主，复杂度低，有利于此 后的PCR反应。
具体实施方式
八本实施方式与具体实施方式
六的不同点是步骤一所设计的目 的基因特异性逆转录引物与RNA的结合位点与该目的基因mRNA的5’端的距离为30 200bp。其它步骤及参数与实施方式六相同。
具体实施方式
九本实施方式与具体实施方式
六的不同点是步骤一所设计的目 的基因特异性逆转录引物与RNA的结合位点与该目的基因mRNA的5’端的距离为40 180bpo其它步骤及参数与实施方式六相同。
具体实施方式
十本实施方式与具体实施方式
六的不同点是步骤一所设计的目的基因特异性逆转录引物与RNA的结合位点与该目的基因mRNA的5’端的距离为50 150bp。其它步骤及参数与实施方式六相同。
具体实施方式
十一本实施方式与具体实施方式
六的不同点是步骤一所设计的 目的基因特异性逆转录引物与RNA的结合位点与该目的基因mRNA的5’端的距离为60 IOObp0其它步骤及参数与实施方式六相同。
具体实施方式
十二 本实施方式与具体实施方式
六至十一之一的不同点是步骤 一所设计的接头序列长度大于40bp。其它步骤及参数与实施方式六至十一之一相同。本实施方式中接头序列长度越长越有利于设计较多的巢式锚定引物，并可以降低 巢式锚定引物在该物种基因组或cDNA中发生非特异扩增的概率。
具体实施方式
十三本实施方式与具体实施方式
六至十二之一的不同点是步骤 一所设计的巢式锚定引物为2 10条。其它步骤及参数与实施方式六至十二之一相同。本实施方式中控制巢式锚定引物的Tm值不低于58°C。本实施方式在扩增目的基因片段之前可通过单引物PCR对各个巢式锚定引物进 行预试，筛选出无可见非特异扩增产物的引物用各个巢式锚定引物分别对目的物种的基 因组DNA或是对基因无选择性的总cDNA进行单引物的PCR，弃用单引物扩增严重(即单引 物PCR得到清晰条带或弥散条带)的引物，以提高巢式PCR的效率；保留在目的物种中单引 物PCR无可见扩增产物的锚定引物，可以继续用于同一物种中其它基因的克隆。
具体实施方式
十四本实施方式与具体实施方式
六至十二之一的不同点是步骤 一所设计的巢式锚定引物为3 5条。其它步骤及参数与实施方式六至十二之一相同。
具体实施方式
十五本实施方式与具体实施方式
六至十四之一的不同点是步骤 一所设计的目的基因特异性巢式PCR引物为2 4条。其它步骤及参数与实施方式六至 十四之一相同。本实施方式中将距未知部分(CDNA3’末端)最远的目的基因特异性逆转录引物 命名为GSP-RT，由于逆转录反应的链延伸温度通常最高可达45°C，因此，控制GSP-RT的 Tm值在50°C左右。各条目的基因巢式PCR引物从靠近GSP-RT —侧起依次命名为GSP-I、 GSP-2.......GSP-n，选择Tm值较高的巢式PCR引物，引物的Tm值不低于58°C。本实施方式逆转录反应结束后将产物进行适当倍数的稀释，作为PCR反应的模 板。各条巢式锚定引物与目的基因特异性巢式PCR引物可随意搭配，但需注意相对位置 先用相距较远的巢式锚定引物和目的基因特异性引物和目的基因巢式PCR引物进行PCR扩 增，再将产物作为下一轮PCR的模板，换用相距次远之的引物进行巢式或半巢式PCR。每次 进行巢式PCR时，尽量分别回收上一轮PCR所得的条带作为模板，若上一轮PCR获得弥散的 条带，或是条带几乎不可见，也可直接将此产物稀释一定倍数作为模板。由于待扩增的片段序列未知，因此设计的引物有可能在目的片段上有不只一处非 特异的结合位点，因此，在各轮PCR中都要带有单引物PCR的对照，以排除某条引物发生单 引物扩增的产物。也可以在克隆正式开始之前，用各条引物分别对逆转录产物进行单引物 PCR，筛选出单引物PCR无可见扩增产物的引物。
具体实施方式
十六本实施方式与具体实施方式
六至十五之一的不同点是步骤一所设计的目的基因特异性巢式PCR引物及巢式锚定引物之间的Tm值相差小于1°C。其它 步骤及参数与实施方式六至十五之一相同。本实施方式中目的基因特异性巢式PCR引物及巢式锚定引物的Tm值比较接近，且 各引物在模板中基本不发生非特异扩增，这样便于在克隆时将不同的目的基因巢式PCR引 物与不同的锚定引物随意搭配。
具体实施方式
十七本实施方式与具体实施方式
六至十六之一的不同点是步骤 四中验证采用以下步骤将步骤三巢式PCR扩增片段的测序结果与目的基因中已知序列进 行拼接，然后将拼接得到的序列进行比对和完整性分析，再在拼接所得序列两端设计引物， 通过PCR和测序确认拼接结果。其它步骤及参数与实施方式六至十六之一相同。本实施方式在得到目的基因未知部分的扩增产物后，将扩增产物回收，与克隆载 体连接，通过测序即可得知未知片段的序列。将测序结果与已知序列拼接，即可推断出基因 编码区的完整序列。通过BlastX可分析所得序列的正确性和完整性。再在序列拼接结果 的两端设计引物，对目的物种的基因组DNA或无基因选择性的cDNA进行PCR扩增，将得到 的产物再次回收、测序，获得目的基因编码区真实、完整的序列。
具体实施方式
十八本实施方式根据野生大豆中一个已知3’ -EST(genbank登录 号为DT083046，如SEQ ID NO 1所示)进行基因完整编码序列扩增一、根据目的基因及目的物种设计目的基因特异性逆转录引物、目的基因特异性 巢式PCR引物以及接头序列，并根据接头序列设计巢式锚定引物，接头序列的3’末端设计 有4个连续的鸟嘌呤；二、使用Trizol提取野生大豆叶片总RNA，取1 μ g总RNA，使用Takara-BD公司的 Powerscript逆转录酶进行逆转录，逆转录反应以基因特异引物GSP-RT起始，在反应体系 中加入接头，延伸温度为45度；Powerscript逆转录酶具有末端转移酶活性，可选择性地在 充分延伸至mRNA 5’末端的cDNA上加上接头序列；三、以上一步骤3’端添加了接头的单链cDNA片段为模板，用目的基因特异性巢式 PCR引物和巢式锚定引物进行巢式PCR扩增；PCR反应均采用三步法94°C变性，降落法退 火，72°C延伸，共30个循环；其中退火温度从引物Tm+5°C降到引物Tm-10°C，每个循环降低 0. 5°C ；将逆转录产物稀释5倍作为模板，以GSP-I和APl为引物进行第一轮PCR扩增(第 一轮PCR扩增结果如图3所示)；再将第一轮PCR产物稀释100倍作为模板，以GSP2和AP2 为引物进行第二轮PCR扩增(第二轮PCR扩增结果如图4所示)；再将第二轮PCR产物回 收并稀释100倍作为模板，以GSP3和AP3为引物进行第三轮PCR扩增(第三轮PCR扩增结 果如图5所示)；四、对步骤三获得的巢式PCR扩增片段进行测序，再利用软件分析，获得目的基因 3’末端至5’末端的序列，验证后即得到目的基因完整编码序列；其中步骤一所设计的巢式 锚定引物在目的基因所在的物种基因组或cDNA中无可见非特异扩增产物。本实施方式中选用的野生大豆(Glycine soja)的一条已知3’ -EST(被命名为 PTE-234)，经BlastX程序分析的结果表明此序列已包含目的基因编码区3’末端，距5’末 端还有约270aminO acids (氨基酸)的氨基酸序列，即有> 800bas印air (碱基对)的核苷 酸序列未知，如图2所示。本实施方式步骤一中设计了目的基因特异性巢式PCR引物3条，将距未知部分(cDNA3’末端)最远的目的基因特异性逆转录引物命名为GSP-RT，目的基因特异性巢式PCR 引物从靠近目的基因特异性逆转录弓I物一侧起依次命名为GSP-I、GSP-2和GSP-3。GSP-RT :5，-CCTCCTCTAACAATCAAG-3，；GSP-I :5，-CTAACAATCAAGTTTAGCAAGAAATCC-3，；GSP-2 :5， -CCTCTAGCAACCTATTCAACTTTCTG-3，；GSP-3 :5， -AGATTATGGAACTCTGCCTTTATGTC-3，。本实施方式步骤一中设计了 3条巢式锚定引物，本实施方式中巢式锚定引物与目 的基因特异性逆转录引物、目的基因特异性巢式PCR引物的Tm值应比较接近。从靠近cDNA 5’端起巢式锚定引物依次命名为APl AP3。APl :5，-ATAGCAGTGTGATACCATGAGACG-3，；AP2 :5， -GTGTGATACCATGAGACGGGC-3，；AP3 :5， -GGCACATTACGGCTCGGG-3，。本实施方式步骤一中设计的接头序列为5，-ATAGCAGTGTGATACCATGAGACGGGCACATT ACGGCTCGGGG-3，。本实施方式步骤二中选用Takara-BD公司的Powerscript逆转录酶，Powerscript 酶在延伸之后，会在所合成的cDNA链3’端添加3个dC(胞嘧啶)，故此接头序列的3’末端 设计为4个连续的dG(鸟嘌呤)。此引物适用于在延伸之后被添加3 4个dC的cDNA。经本实施方式步骤三操作，得到了 3条清晰的产物条带。图3 5中的“2”和“3” 泳道均为当轮PCR所使用引物的单引物扩增结果，其中无可见的单引物扩增产物，表明目 的基因特异性巢式PCR引物及锚定引物几乎未发生单引物的非特异扩增。因此，本实施方 式接头序列及3条巢式锚定引物适合继续用于野生大豆中其它基因5’端未知片段的扩增。本实施方式在3次巢式PCR所得的条带中，有一条大小在750bp IOOObp之间 的清晰条带，与预期结果比较相符。回收此条带测序后与已有EST(PTE-234)拼接，并通过 BlastX分析拼接，分析拼接结果如图6所示，初步证明所获得的是目的基因未知部分的序 列，且已包含编码区完整5’末端。至此，由总RNA的制备开始，共经过了 1个逆转录反应和3个PCR反应，即得到了 目的片段的扩增结果。测序结果表明，此扩增结果正确、完整。验证试验根据拼接结果预测基因的完整编码序列，在预测的编码区两端设计全长验证引 物，以野生大豆的总cDNA为模板，进行PCR扩增，得到了大小符合预期结果的条带(如图7 所示)，将所得条带测序，获得了目的基因编码区完整、确切的序列(目的基因在genbank登 录号为⑶474544)，此完整序列BlastX分析结果与拼接所得序列的BlastX结果(图6) — 致，并包含了完整的开放读码框(open reading frame, 0RF)，ORF预测结果如图8所示。
具体实施方式
十九本实施方式接头序列为适用于野生大豆(Glycine soja)的 5，-RACE 接头序列，该 5，-RACE 接头序列为 5，-ATAGCAGTGTGATACCATGAGACGGGCACATTACGGC TCGGGG-3’ ；并设计了与本实施方式5’ -RACE接头序列相应的巢式锚定引物，巢式锚定引物 序列如SEQ ID NO :7 9所示。
权利要求
5’-RACE接头序列添加方法，其特征在于5’-RACE接头序列按以下步骤添加一、根据目的基因设计目的基因特异性逆转录引物，根据目的基因所在物种基因组特征设计接头序列，接头序列的3’末端设计有至少3个连续的鸟嘌呤；二、在逆转录体系中加入接头和目的基因特异性逆转录引物，然后用有末端转移酶活性的逆转录酶进行逆转录，实现了5’-RACE接头序列添加。
2.根据权利要求1所述的5’-RACE接头序列添加方法，其特征在于步骤一所设计的目 的基因特异性逆转录引物与mRNA的结合位点与该目的基因CDNA3’端接近。
3.根据权利要求1所述的5’-RACE接头序列添加方法，其特征在于步骤一所设计的接 头序列的3’末端设计有3个、4个、5个、6个、7个或8个连续的鸟嘌呤。
4.接头序列，适用于野生大豆(Glycinesoja)的5’-RACE接头序列，其特征在于该 5，-RACE 接头序列为 5，-ATAGCAGTGTGATACCATGAGACGGGCACATTACGGCTCGGGG-3，。
5.5’端未知基因完整编码序列的扩增方法，其特征在于5’端未知基因完整编码序列按 以下步骤进行扩增一、根据目的基因及目的物种设计目的基因特异性逆转录引物、目的基因特异性巢式 PCR引物以及接头序列，并根据接头序列设计巢式锚定引物，接头序列的3’末端设计有至 少3个连续的鸟嘌呤；二、在逆转录体系中加入接头和目的基因特异性逆转录引物，然后用有末端转移酶活 性的逆转录酶进行逆转录，获得3’端添加了接头序列的单链cDNA片段；三、以3’端添加了接头的单链cDNA片段为模板，用目的基因特异性巢式PCR引物和巢 式锚定引物进行巢式PCR扩增；四、对步骤三获得的巢式PCR扩增片段进行测序，再利用软件分析，获得目的基因3’末 端至5’末端的序列，验证后即得到5’端未知目的基因的完整编码序列；其中步骤一所设计 的巢式锚定引物在目的基因所在的物种基因组或cDNA中无可见非特异扩增产物。
6.根据权利要求5所述的基因完整编码序列的扩增方法，其特征在于步骤一所设计的 目的基因特异性的巢式PCR引物与cDNA的结合位点与该目的基因CDNA3’端接近。
7.根据权利要求5所述的基因完整编码序列的扩增方法，其特征在于步骤一所设计的 接头序列长度大于40bp。
8.根据权利要求5、6或7所述的基因完整编码序列的扩增方法，其特征在于步骤一所 设计的巢式锚定引物为2 10条；步骤一所设计的目的基因特异性巢式PCR引物为2 4^^ o
9.根据权利要求8所述的基因完整编码序列的扩增方法，其特征在于步骤一所设计的 目的基因特异性巢式PCR引物之间的Tm值相差小于1°C。
10.根据权利要求5、6、7或9所述的基因完整编码序列的扩增方法，其特征在于步骤四 中验证采用以下步骤将步骤三巢式PCR扩增片段的测序结果与目的基因中已知序列进行 拼接，然后将拼接得到的序列进行比对和完整性分析，再在拼接所得序列两端设计引物，通 过PCR确认拼接结果。
全文摘要
5’-RACE接头序列添加方法及接头序列和5’端未知基因完整编码序列的扩增方法，它涉及一种接头序列添加方法及接头序列和基因完整编码序列的扩增方法。它解决现有接头序列添加方法存在的对mRNA 5’末端信息的完整性没有选择性及模板复杂度高等缺陷。5’-RACE接头序列添加一、根据目的基因与目的物种设计特异性逆转录引物和接头序列；二、逆转录添加接头序列。接头序列如SEQ ID NO10所示。5’端未知基因完整编码序列扩增一、设计引物；二、逆转录并添加接头；三、巢式PCR扩增；四、测序，分析。本发明5’-RACE接头序列添加方法具有对mRNA 5’末端信息的完整性有选择性及基因克隆效率高等优点。
文档编号C12N15/10GK101864413SQ201010184510
公开日2010年10月20日 申请日期2010年5月27日 优先权日2010年5月27日
发明者才华, 朱延明, 李勇, 柏锡, 王希, 纪巍 申请人:东北农业大学