不久前，《细胞》杂志（Cell）在线发表了一篇关于新冠抗体研发的重要论文。科学家们在大羊驼体内找到了多种“纳米抗体”，可在体外实验中有效中和SARS、MERS以及新冠病毒的假病毒（pseudoviruses）。这一研究再次引起了业内对纳米抗体技术的关注。事实上，纳米抗体有着巨大的应用潜力和前景。Fierce Biotech曾将Ablynx公司的纳米抗体技术平台，评为未来十年生物技术制药领域最为领先的十大技术平台之首。
什么是纳米抗体？简单来说，它是一类仅含有天然存在的重链、尺寸比普通抗体要小得多的抗体。由于结构独特，纳米抗体成为创造具有多种竞争优势新型生物药物的理想材料。实际上，将纳米抗体开发成药的概念已在临床上得到验证，2018年全球首个纳米抗体Cablivi（caplacizumab）在欧盟获批上市。
1989年Raymond Hamers等人对单峰骆驼免疫系统进行了开创性的研究，标志着重链治疗性抗体的发现.7只重链抗体和传统抗体在轻链上有所不同，重链抗体没有可变和恒定的轻链以及CH1域（下图A）。类似的重链抗体被发现在鲨鱼等鲤鱼中，然而，这些重链抗体被称为IgNAR抗体，有5个恒定的（CH）域，并且由于在免疫鲨鱼方面的困难，工程和开发具有挑战性。传统的抗体在重链和轻链上含有6个互补决定区（CDR），而重链抗体只拥有3个CDR（下图B）。尽管只有3个CDR，但与传统的6个CDR抗体相比，这些仅重链抗体表现出相当的抗原结合亲和力和其他效应器功能。
作为癌症治疗的纳米抗体
癌症免疫学的进展为许多新的治疗策略铺平了道路，包括抗体和纳米抗体及其检测肿瘤细胞和激活免疫系统效应反应的能力。这些突破性的癌症免疫治疗方法包括检查点抑制的识别和治疗性失活、抗原呈递细胞（APCs）的激活、免疫抑制细胞的阻断、免疫抑制分子的中和、嵌合抗原受体T细胞（CAR T细胞）和CAR-自然杀伤（NK）细胞的开发、细胞因子调控等。
纳米抗体和T细胞在癌症免疫治疗中的应用
目前，有三种类型的双特异性抗体存在，具有特定的好处；双特异性T细胞酶（BiTE）、双亲和重定向蛋白（DARTs）和串联二抗体（TandAbs）.BiTE抗体的开发是为了将T细胞与肿瘤细胞连接起来，由两个scFv片段组成，一个针对T细胞的抗原/标记物，如CD3，另一个针对TAA，再加上一个肽连接物。Blinatumomab是食品和药物管理局(FDA)批准的一种BiTE，用于治疗B细胞急性淋巴细胞白血病(B-ALL)，对T细胞的CD3和B细胞的CD19(在ALL中过度表达)具有特异性，与甘氨酸-丝氨酸连接体相连。这种抗体表现出良好的疗效，但半衰期较短，这是blinatumomab以及其他BiTEs的一个主要问题，需要高治疗剂量才能达到所需的T细胞活化.DARTs已被开发为一种al-ternative，以克服BiTEs的短半衰期并解决快速消除问题。与BiTEs不同的是，DARTs具有Het-erodimerized Fv片段，Fv1片段上有靶点A的VL和靶点B的VH，Fv2片段上有靶点B的VL和靶点A的VH48（图2B）。
与传统的BiTEs相比，稳定性、溶解性和性能显著提高的双特异性纳米抗体也有望呈现出更高的疗效。最近，开发了一种针对T细胞CD3和乳腺癌细胞Her2的双特异性抗体。这种治疗方法的独特性是结合了对Her2特异性的单域(VHH)和对CD3特异性的scFv-fragment.这种构建体能够很容易地在大肠杆菌中表达并通过亲和层析进行纯化。
cd T淋巴细胞
cd T淋巴细胞存在的数量不多，但在抗肿瘤活动中起着关键作用。这种小的T细胞亚群在免疫反应中具有许多独特的特性，它们不需要主要组织相容性com- plex（MHC）就能被激活；受应激抗原刺激。DNAM-1(DNAX附属分子-1)、CD27等刺激。
cd T淋巴细胞有一些子集--调节性的cdT和cdT17细胞促进肿瘤生长，而Vc9Vd2 T细胞抑制肿瘤生长，并且具有不同的activation分子和途径，这使得它们可以被靶向治疗，许多纳米抗体已经被开发出来。
NK细胞
NK细胞是先天性淋巴细胞，在抗病毒和抗肿瘤免疫反应中具有举足轻重的作用。它们不需要MHC的呈现来激活，通过许多受体，如CD94/NKG2A、KIR、天然细胞毒性受体NKp46、NKp30、NKp44、IgG受体FccRIII和许多其他C型凝集素样受体，利用激活和抑制（杀伤和不杀伤）信号已经开发了大量的纳米体构建物来靶向NK细胞的FccRIII（CD16）。在骆驼中生成了两个针对FccRIII胞外域的骆驼纳米抗体（C21和C28），对FccRIIIb+聚吗啡有显著亲和力。
纳米抗体-药物共轭物
将纳米抗体等靶向治疗与化疗/放疗等非靶向治疗相结合，是对以往方法的一种进步。科研人员将一个VHH7域(针对MHC类-II)作为治疗剂，同时也是B细胞淋巴瘤的想象工具.当VHH7域与含硫代梅坦辛衍生物默坦辛(DM1)共轭并作为治疗剂使用时，在A20 B细胞淋巴瘤的小鼠模型中表现出极好的特异性、内化性和细胞毒性，它导致肿瘤生长和转移的减少(图2F)。同样的VHH7域，当与近红外（NIR）荧光团结合时，在可视化局部和转移性肿瘤细胞方面表现出优异的诊断性能同样，作为新的靶向构建体，靶向放射性核素治疗与纳米抗体的结合正在获得巨大的关注。
纳米体酶结合物是另一种纳米体-酶结合物为基础的方法，在消除肿瘤方面表现出了良好的活性。2004年有科学家开发了一种纳米体酶结合物，cAb-CEA5:bL来靶向肿瘤相关的CEA114(图2G)。该纳米体与Enterobacter cloacae b-lactamase酶共轭，该酶可特异性地激活抗肿瘤原药7-(4 carboxybutanamido cephalosporin mustard)，使其成为活性药物苯二胺芥。共轭使用llama c2c铰链进行，以提供灵活性和稳定性，并显示出从系统循环中快速清除和在肿瘤中的浓度，从而避免脱靶毒性。
基于纳米抗体的CAR T细胞治疗
2018年首次推出基于纳米抗体的CAR T细胞疗法，以VHH域针对MUC-1和CD28和OX40为共刺激分子，在肿瘤异种移植中观察到该CAR T细胞对MUC-1+肿瘤细胞的杀伤作用，并结合促炎细胞因子IL-17和IFN-的产生增加。
这个NanoCAR系统被进一步增强了一个自杀基因系统，以避免对健康细胞造成不必要的损害，并控制不必要的复制。在这个系统中，一个使用了同二聚体调控的caspase 8，该caspase 8被合成配体AP20187激活，以诱导apo-ptosis。
除了肿瘤微环境外，治疗实体瘤的一个重大挑战是肿瘤特异性靶点识别。为了解决这个问题，麻省理工学院和哈佛大学的研究人员开发了基于纳米体的CAR T细胞，其靶向是一般的肿瘤微环境，特别是存在于多种肿瘤类型上的PD-L1和EIIIB.这些纳米CAR T细胞疗法在许多肿瘤中表现出了很好的识别和结合活性，当激活时还能分泌IL-2和IL-12，这增加了肿瘤的炎症。
基于双特异性纳米体的Car T细胞疗法也已经被开发出来，因为依靠单一抗原进行肿瘤识别通常是不够的，并导致抗原阴性肿瘤的治疗失败。2018年科学家开发了两种针对CD20和HER2的NanoCAR；抗原结合域由两个VHH串联域组成，针对肿瘤细胞上两种不同的抗原，这种NanoCar方法通过克服肿瘤上抗原丢失的问题，在消除肿瘤方面表现出了良好的潜力。此外，还开发了一种基于纳米体的抗EGFR+肿瘤的UniCAR。与传统CAR不同的是，这种UniCAR的活性可以通过重组靶向模块表位进行调控并靶向肿瘤特异性抗原，从而消除了细胞因子综合征和CAR T细胞过度外显等不必要的风险。这种基于纳米抗体的UniCAR显示出可控的、实质性的肿瘤细胞溶解和良好的生物分布，并具有较长的半衰期。一些在临床前开发中的纳米抗体列在下表中。
结论
纳米抗体具有良好的动态特性、契约大小、热稳定性、穿透能力（甚至可以穿过BBB）、高溶解度和低免疫原性，使其成为非常有前景的治疗分子。易操作和低成本的生产进一步增加了它们作为治疗药物的前景。它们通过激活效应细胞和抑制免疫抑制的几种动态策略，被用于治疗多种疾病，特别是癌症。缺少VL-VH域的双特异性纳米抗体表现出令人印象深刻的稳定性，聚合度极低。许多裸露的拮抗性纳米体构建体通过阻断离子通道、生长因子受体，显示出对肿瘤发生途径的成功灭活。它们的微小尺寸显示了纳米抗体和纳米抗体-药物共轭物的可重复标记的组织渗透和生物分布，这为对抗实体瘤打开了大门，增强了疗效。纳米抗体在光热治疗和光动力治疗中的应用具有良好的抗肿瘤反应。合成生物学的进展导致了益生菌的发展，益生菌能够在肿瘤微环境中合成治疗性的抗肿瘤纳米抗体，以避免与conven- tional检查点抑制剂的毒性挑战。以纳米抗体为可变域的CAR T和CAR NK细胞，开发出了具有优异抗肿瘤活性和肿瘤特异性的双特异性CAR T和CAR NK细胞。它们的潜力吸引了许多制药公司的兴趣，目前纳米抗体已成为许多药物管线中的主要产品。最近FDA批准了CABLIVI纳米体用于治疗血栓性血小板减少性紫癜，进一步高光了它们在市场上的出现，它们无疑将继续革新治疗方案。
