3496 人阅读 发布时间:2021-05-21 13:56
CRISPR-Cas9作为目前最常使用的基因编辑系统,已广泛应用于人类细胞、斑马鱼、小鼠以及细菌的基因组精确修饰。CRISPR-Cas9基因编辑技术在一系列基因治疗的应用领域都展现出极大的应用前景,例如血液病、肿瘤和其他遗传疾病。然而,在基因编辑实验中我们却经常会被一些问题所困扰,特别是对于新手小白来说。下面小编就以riboEDIT™ CRISPR-Cas9为例,汇总了基因编辑实验中常见的一些问题解答,希望可以对正在或即将要进行CRISPR-Cas9基因编辑实验的各位小伙伴们有所帮助!
riboEDIT™ CRISPR-Cas9是锐博生物自主开发的采用天然复合物系统的即用型(Ready-to-Use)基因编辑体系,gRNA采用crRNA和tracrRNA,提供全RNA体系(crRNA+tracrRNA+Cas9 mRNA)和RNP体系(crRNA+tracrRNA+Cas9 Protein),充分借助化学合成技术优势和质谱检测以确保质量稳定,通过化学转染、显微注射或电穿孔/电转进行编辑,是大规模文库筛选的理想选择。该体系不需要自行构建gRNA载体或Cas9载体,无需病毒实验室,无需前期测序鉴定,无DNA组分,不整合病毒或质粒基因,轻松实现单靶点或多靶点编辑,简化基因编辑实验步骤,数倍缩短实验时间。还提供编辑效率保证套装和配套必需试剂,为基因编辑提供方便、省时、高效的解决方案。
答:体外转录或克隆形成的single guide RNA(即sgRNA),长度约100 mer,需经历摇菌培养、载体表达、挑选阳性克隆、测序鉴定等,或通过包病毒步骤,非常繁琐。构建好的gRNA质粒、慢病毒、腺病毒会整合到宿主基因,载体体积大,免疫源性,转染效率低、细胞毒性大、死亡率高、激活先天免疫等。
riboEDIT CRIPSR-Cas9系统采用近两年来被全球科学家越来越多采用的天然复合物gRNA,即crRNA和tracrRNA,无需体外转录,采用高通量化学合成以确保其纯度、效力和批次稳定性。因不需要载体或病毒,上述问题可避免。其中,crRNA和tracrRNA为专利技术优化,缩短了碱基序列长度。不同于常规gRNA,由crRNA、tracrRNA与S. pyogenes Cas9(编码序列经人源密码子优化)构成编辑效率更高的CRISPR-Cas9体系,如下图所示。
(1)Cas9蛋白为瞬时表达,脱靶效率低、无DNA整合风险和启动子兼容性问题,大大提高应用安全性。
(2)即用型体系,通过一步转染,5-6个工作日即可完成编辑效率检测,操作简便,显著缩短实验周期。
(3)不需要自行构建载体或包装慢病毒,不需要病毒级的实验室环境。
(4)在大部分细胞中,比质粒表达载体具有更高的基因编辑效率。
(1)细胞转染效率低,建议优化转染步骤或换用容易转染的细胞类型。
(2)Cas9 mRNA 或 Cas9 蛋白降解,可通过设置阳性对照组(riboEDIT Positive Control crRNA #1,货号crRP0001VS)共转染和排除Cas9 mRNA 或 Cas9 蛋白降解的问题。
(3)在细胞内,Cas9核酸酶无法接近靶位点或无法剪切靶位点,建议重新设计crRNA。
(4)没有进行DNA片段的变性、退火步骤。可通过设置阳性对照组确认实验操作是否有误。
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