辣蓼杀虫活性成分研究

曾维爱

【摘要】： 茶树虫害是茶叶高产、优质、高效的重要制约因素之一。茶树害虫种类繁多，全世界已记载的有1000多种，我国常见害虫有400多种，其中重要的有50-60种，常年造成茶叶产量损失约15％。茶尺蠖(Ectropis grisecens warren)是我国茶园三大主要害虫(茶尺蠖、茶毛虫、小绿叶蝉)之一，长期以来危害我国茶园，该虫发生代数多，为害时间长。目前，防治茶尺蠖使用的药剂一般为功夫、天王星和敌杀死，长期使用这些农药，使得茶尺蠖的抗药性逐年增强，药效下降，尤其是茶叶中农药残留量较高是当前茶叶生产中面临的严重问题。为解决茶尺蠖的危害及降低茶叶中的农药残留量，研制并推广高效、低毒、低残留的无公害杀虫剂，替代有机化学农药势在必行。同时研制与推广无公害杀虫剂也是发展无公害茶叶的一个关键，对提高茶叶的产量和品质，保持茶园的生态平衡，保护和利用茶园天敌资源，具有十分重要的意义。 生物农药替代化学农药是无公害农业发展的必然趋势，我国在生物农药方面的研究尽管开展了不少工作，但是具有原创性的自主知识产权的产品还很少，然而，有机食品、绿色食品的发展期待生物农药替代传统的化学农药。从天然产物，特别是从植物中寻找杀虫活性物质，是研制和开发新型杀虫剂的重要途径之一。辣蓼(Polygonum hydropiper L.)属蓼科(Polygonaceae)蓼属(Polygonum L.)的一年生草本植物，是我国的一种传统中草药，在我国大部分地区都有分布，是一种资源十分丰富的植物，辣蓼对昆虫具有很强的拒食、忌避作用，如能将之开发为一种新型的植物性杀虫剂，对充分利用该种植物为农业生产服务具有重要意义。 本实验通过15种植物4种溶剂提取物对茶尺蠖3龄幼虫的生物活性，筛选出辣蓼醇提物的活性最强。对辣蓼醇提物通过5种有机溶剂萃取以茶尺蠖、菜青虫为生测试虫，达到杀虫活性成分的初步分离目标，筛选出乙醚萃取物的活性最强。对辣蓼醇提乙醚萃取物进行GC-MS分析，分析显示出主要化学成分为酚类物质。然后通过不同柱色谱、不同洗脱溶剂系统对辣蓼杀虫活性成分进行追踪分离与纯化，以TLC、HPLC检测，以茶尺蠖为生测试虫，得辣蓼杀虫活性成分。对分离纯化得到的单体进行四谱(IR、MS、UV、NMR)鉴定，通过谱图解析及结合理化实验，确定辣蓼杀虫活性成分为丁香酚。最后用分离得到的丁香酚对茶尺蠖做不同方式的药效实验，并研究了丁香酚对茶尺蠖的乙酰胆碱酯酶和谷胱甘肽-S-转移酶活性的影响。 主要研究结果如下： 1、通过15种植物4种溶剂提取物对茶尺蠖3龄幼虫的生物活性实验发现，辣蓼95％乙醇提取物对茶尺蠖具有很好的拒食作用和一定的触杀作用，48h内3次观察的平均拒食率为83.41％，比标准药剂对照(0.3％印楝素乳油)的效果好；3d后的校正死亡率为46.67％，比标准药剂对照的校正死亡率低。 2、通过不同溶剂的超声波辅助提取、回流提取获得粗提物，对粗提物经过不同溶剂萃取得萃取物，以5龄菜青虫为生测试虫。生物活性试验表明，辣蓼粗提物对菜青虫5龄幼虫具有较强的拒食作用和一定的触杀作用，其中以95％乙醇为溶剂的回流提取物的活性最强，处理24 h、48 h后拒食率分别为75.27％和67.04％；24 h，48 h和72 h的校正死亡率分别为14.71％、30.30％和44.83％。萃取物对菜青虫5龄幼虫也具有很强的拒食作用和一定的触杀作用，其中以辣蓼醇提乙醚萃取物的活性最强，处理24 h、48h后拒食率分别为90.57％和82.93％；24h，48h和72h的校正死亡率分别为24.14％、41.07％和56.60％。 3、通过不同溶剂对辣蓼95％乙醇提取物(EE)进行萃取，并将各萃取物对茶尺蠖3龄幼虫进行了拒食作用和触杀作用，生物活性试验表明，EE各萃取物对茶尺蠖3龄幼虫都具有拒食作用和触杀作用，其中以EE乙醚萃取物的活性最强，处理12h、24 h和48h后拒食率分别为99.34％、90.02％和81.25％；触杀作用中，EE乙醚萃取物7d后的校正死亡率为68.49％，表现出一定的触杀作用。 4、对醇提乙醚萃取物进行了GC-MS分析，在辣蓼中首次发现了以下6种化合物：2-甲氧基-4-乙烯基苯酚、4-烯丙基-2-甲氧基苯酚、2，4-二叔丁基苯酚、邻苯二甲酸二异丁酯、邻苯二甲酸二庚酯和邻苯二甲酸二丁酯。其中，2-甲氧基-4-乙烯基苯酚、4-烯丙基-2-甲氧基苯酚(丁香酚)对农业害虫具有很强的生物活性，辣蓼具有的杀虫活性可能与这二种物质有关。 5、对辣蓼杀虫活性成分进行了追踪分离，通过对茶尺蠖的生物活性实验证明，辣蓼杀虫活性部位是精油类成分，并从辣蓼杀虫活性部位中分离得到一个单体化合物，通过理化常数测定与波谱分析，被鉴定为4-烯丙基-2-甲氧基苯酚，俗称丁香酚。 6、丁香酚对茶尺蠖3龄幼虫的不同生物活性测定结果表明：茶尺蠖对丁香酚处理过的叶片的取食量显著少于对照，具有很强的拒食作用；丁香酚对茶尺蠖还具有明显的胃毒作用和触杀作用；另外，丁香酚对茶尺蠖的体重增长也有显著的抑制作用。 7、对辣蓼杀虫活性成分的作用机理进行了初步研究，实验结果表明：丁香酚能显著抑制茶尺蠖的乙酰胆碱酯酶活性，处理后2d的酶比活力抑制率达73.57％，随着处理天数的延长，酶比活力抑制率随着降低，到第5天达最低值，抑制率为40.43％；丁香酚对茶尺蠖的谷胱甘肽-S-转移酶活性也具有一定程度的抑制作用，以处理后2d的酶比活力抑制作用最强，其抑制率达64.26％，处理后3d的抑制率为51.0％，但是到第4d酶比活力的抑制率显著降低，抑制率仅为20.38％，到第5d丁香酚处理对茶尺蠖的谷胱甘肽-S-转移酶活性基本上没有抑制作用，第5d后的抑制率仅为9.38％。

【关键词】：辣蓼茶尺蠖菜青虫丁香酚生物活性生物农药

【学位授予单位】：湖南农业大学

【学位级别】：博士

【学位授予年份】：2007

【分类号】：S435.711;S482.39

【目录】： 中文摘要4-6

Abstract6-15

图目录15-16

表格目录16-18

缩略词表18-19

第一章 绪论19-42

1 研究目的与意义19-20

2 国内外研究动态20-40

2.1 茶尺蠖生物防治研究进展20-24

2.1.1 利用天敌防治茶尺蠖为害20-22

2.1.2 利用昆虫信息素防治茶尺蠖为害22

2.1.3 利用生物农药防治茶尺蠖为害22-23

2.1.4 问题与展望23-24

2.2 植物源农药研究进展24-30

2.2.1 植物源农药的种质资源24-25

2.2.2 植物源农药的杀虫作用机理25-27

2.2.3 植物源农药的活性成分27-28

2.2.4 植物源农药应用现状28-29

2.2.5 问题与展望29-30

2.3 植物精油防治害虫研究进展30-33

2.3.1 植物精油对害虫的引诱作用30-31

2.3.2 植物精油对害虫的忌避、拒食与生长发育抑制作用31-32

2.3.3 植物精油对害虫虫卵、幼虫和成虫的熏蒸、触杀与毒杀作用32-33

2.3.4 问题与展望33

2.4 蓼科杀虫植物—辣蓼33-40

2.4.1 辣蓼的别名及分布34

2.4.2 辣蓼的生物学特性34-35

2.4.3 辣蓼的化学成分35

2.4.4 辣蓼对高等动物的毒性35-36

2.4.5 辣蓼在医药保健中的应用36-37

2.4.6 辣蓼在兽药中的应用37

2.4.7 辣蓼在植物源农药中的应用37-39

2.4.8 问题与展望39-40

3 主要研究内容及技术路线40-42

3.1 主要研究内容40-41

3.2 技术路线41-42

第二章 15种植物4种溶剂提取物对茶尺蠖的生物活性42-53

1 材料与方法42-46

1.1 材料42-44

1.1.1 供试昆虫42

1.1.2 养虫设备42

1.1.3 供试植物42

1.1.4 溶剂及标准药剂42-44

1.1.5 提取分离设备44

1.2 方法44-46

1.2.1 植物提取物的制备44

1.2.2 拒食活性的测定(非选择性试验)44-45

1.2.3 触杀作用的测定(点滴法)45-46

1.2.4 数据统计分析46

2 结果与分析46-51

2.1 不同植物不同溶剂的提取效果46

2.2 15种植物4种溶剂粗提物对茶尺蠖3龄幼虫的拒食作用46-47

2.3 95%乙醇辣蓼提取物对茶尺蠖3龄幼虫的拒食作用47-49

2.4 15种植物4种溶剂粗提物对茶尺蠖3龄幼虫的触杀作用49-50

2.5 95%乙醇辣蓼提取物对茶尺蠖3龄幼虫的触杀作用50-51

3 结论与讨论51-53

第三章 辣蓼提取物对菜青虫的生物活性53-59

1 材料和方法53-54

1.1 材料53

1.1.1 供试材料及昆虫53

1.1.2 供试仪器53

1.2 方法53-54

1.2.1 超声波辅助提取53

1.2.2 回流提取53-54

1.2.3 活性成分的初步分离54

1.2.4 拒食活性的测定(非选择性试验)54

1.2.5 触杀作用的测定(点滴法)54

2 结果与分析54-58

2.1 辣蓼不同溶剂不同提取方法的提取率54

2.2 萃取法对辣蓼95%乙醇回流提取物(PHEE)的初步分离效果54-55

2.3 辣蓼粗提物对菜青虫的拒食活性55-56

2.4 辣蓼粗提物对菜青虫的触杀作用56-57

2.5 萃取物对菜青虫的拒食活性57-58

2.6 辣蓼95%乙醇回流提取物(PHEE)的不同萃取物对菜青虫的触杀作用58

3 结论与讨论58-59

第四章 辣蓼杀虫活性成分的初步分离59-64

1 材料和方法59-61

1.1 材料59-60

1.1.1 供试昆虫59

1.1.2 供试植物59

1.1.3 溶剂及标准药剂59

1.1.4 仪器设备59-60

1.2 方法60-61

1.2.1 活性成分的初步分离60

1.2.2 拒食活性的测定(非选择性试验)60

1.2.3 触杀作用的测定(点滴法)60

1.2.4 数据统计分析60-61

2 结果与分析61-63

2.1 萃取法对辣蓼嫩枝95%乙醇回流提取物(EE)的初步分离效果61

2.2 辣蓼嫩枝95%乙醇回流提取物(EE)的不同萃取物对茶尺蠖的拒食活性61

2.3 辣蓼嫩枝95%乙醇回流提取物(EE)的不同萃取物对茶尺蠖的触杀作用61-63

3 结论与讨论63-64

第五章 辣蓼醇提乙醚萃取物的化学成份预试64-71

1 材料与方法64-67

1.1 材料64

1.1.1 实验材料64

1.1.2 主要仪器64

1.1.3 主要试剂64

1.2 方法64-67

1.2.1 主要试剂的配制64-65

1.2.2 有效成份的预试65-67

1.2.3 醇提乙醚萃取物的GC-MS分析67

2 结果与分析67-70

2.1 系统预试结果67-68

2.2 醇提乙醚萃取物的GC-MS分析结果68-70

3 结论与讨论70-71

第六章 辣蓼杀虫活性成分的追踪分离与纯化71-77

1 材料与方法71-73

1.1 材料71

1.1.1 供试昆虫71

1.1.2 实验材料71

1.1.3 主要仪器71

1.1.4 主要试剂71

1.2 方法71-73

1.2.1 乙醚萃取部位及有效流分的薄层展开剂的筛选71-72

1.2.2 乙醚萃取部位硅胶柱层析组分的制备72

1.2.3 乙醚萃取部位有效流分(E3)硅胶柱层析组分的制备72-73

1.2.4 拒食活性的测定(非选择性试验)73

2 结果与分析73-76

2.1 乙醚萃取部位(E)及有效流分(E3)的薄层展开剂的筛选结果73

2.2 乙醚萃取部位的不同流分对茶尺蠖的拒食作用73-75

2.3 乙醚萃取部位有效流分(E3)的不同流分对茶尺蠖的拒食作用75-76

3 结论与讨论76-77

第七章 辣蓼杀虫活性成分的确定与波谱学分析77-85

1 材料与方法77-79

1.1 材料77-78

1.1.1 主要仪器77

1.1.2 实验材料77-78

1.1.3 主要试剂78

1.2 方法78-79

1.2.1 有效成分的分离78

1.2.2 层析流分检测条件78-79

1.2.3 纯度检查79

2 结果与分析79-84

2.1 化合物纯度的检查79-80

2.1.1 TLC检测结果80

2.1.2 HPLC检测结果80

2.2 功能基测定结果80-81

2.3 化合物DT-1的光谱测定结果81-84

3 结论与讨论84-85

第八章 辣蓼杀虫活性成分作用机理初探85-98

1 材料与方法85-89

1.1 材料85-86

1.1.1 供试昆虫85

1.1.2 供试材料85

1.1.3 主要仪器85

1.1.4 主要试剂及配制85-86

1.2 方法86-89

1.2.1 拒食活性的测定(非选择性试验)86

1.2.2 触杀作用的测定(点滴法)86

1.2.3 胃毒作用的测定(叶片夹毒法)86-87

1.2.4 生长抑制作用的测定87

1.2.5 蛋白量的测定87

1.2.6 乙酰胆碱酯酶活力的测定87-88

1.2.7 谷胱甘肽-S-转移酶(GST)活力的测定88-89

2 结果与分析89-94

2.1 丁香酚对茶尺蠖3龄幼虫的拒食作用89-90

2.2 丁香酚对茶尺蠖3龄幼虫的触杀作用90-91

2.3 丁香酚对茶尺蠖3龄幼虫的胃毒作用91

2.4 丁香酚对茶尺蠖3龄幼虫的生长抑制作用91-92

2.5 Bradford法测定蛋白量的BSA标准曲线92-93

2.6 辣蓼活性成分对茶尺蠖乙酰胆碱酶活性的影响93-94

2.7 辣蓼活性成分对茶尺蠖谷胱甘肽转移酶活性的影响94

3 结论与讨论94-98

3.1 丁香酚的杀虫作用是对茶尺蠖各组织影响的综合效应94

3.2 丁香酚可能因干扰昆虫嗅觉感受器导致试虫拒食94-95

3.3 丁香酚对试虫的生长发育抑制作用机理极为复杂95

3.4 丁香酚作为一种杀虫物质，具有极为广阔的发展前景95

3.5 丁香酚对茶尺蠖乙酰胆碱酯酶活性的影响95-96

3.6 丁香酚对茶尺蠖谷胱甘肽-S-转移酶活性的影响96

3.7 辣蓼作为一种杀虫植物，具有极为广阔的发展前景96

3.8 有必要补充的工作96-98

第九章 结论、创新点与展望98-111

1、全文主要结论98-99

2、全文主要创新点99-111

附录A 辣蓼醇提乙醚萃取物主要化合物的峰质谱图及标准谱图111-114

附录B 化合物DT-1的光谱图114-118

附录C 辣蓼杀虫活性成分的提取、分离流程图118-119

致谢119-120

作者简介120-121

攻读博士学位期间参与的主要课题121

攻读博士学位期间发表的论文121

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