4、菌种的鉴定
1）菌种鉴定技术
用于鉴定的形态学特征
用于鉴定的生理生化特征
用于鉴定的遗传学特征
2）细菌的鉴定
细菌的鉴定流程图
形态学--革兰氏染色
细菌学上最常用的鉴别染色法。
该染色法能将细菌分为G+菌和G-菌。
原理：由这两类菌的细胞壁结构和成分的不同所决定的。
G-菌的细胞壁较多易被乙醇溶解的类脂质、肽聚糖层较薄、交联度低，故用乙醇或丙酮脱色时溶解了类脂质，增加了细胞壁的通透性，使初染的结晶紫和碘的复合物易于渗出，结果细菌就被脱色，再经蕃红复染后就成红色。G+菌细胞壁中肽聚糖层厚且交联度高，类脂质含量少，经脱色剂处理后反而使肽聚糖层的孔径缩小，通透性降低，因此细菌仍保留初染时的颜色。
G+菌和G-菌细胞壁结构和成分比较
革兰氏染色步骤
常见革兰氏菌污染来源
革兰氏阳性球菌：
产品样本、水、环境监测中发现的大多数阳性球菌来自人，有些可能来源于天然来源的原料。
药品生产中包括无菌工艺，最常见的污染物是革兰氏阳性球菌，有葡萄球菌属、微球菌属、链球菌属。
人源污染的细菌经常与不规范的无菌行为和操作、裸露的皮肤或头发(人类脱落)有关。
革兰氏阳性杆菌：
污染物通常来自于环境，特别是土壤或尘埃，也会来自原料，如聚乙二醇(PEG)。
生物工艺最常见的革兰氏阳性杆菌污染，是芽孢杆菌属和类芽孢杆菌属，它们产生的内生芽孢对环境压力有高耐受性。
芽孢杆菌属污染与缺乏无菌操作意识，材料和表面的消毒不彻底，无效SIP循环，违反无菌原则，以及污染的原料有关。
革兰氏阴性杆菌：
污染通常来自水源、土壤、植被、原料。
革兰氏阴性杆菌包括大肠杆菌属，假单胞菌属，伯霍尔德杆菌属，劳尔氏菌属、狭长平胞属等。
事实上， 水和液体系统中通常发现存在这些属的微生物污染。
所以，在生物工艺操作样品中通常不会发现革兰氏阴性杆菌。产品污染革兰氏阴性杆菌经常与积水、设备的清洁维护保养护操作不彻底相关。革兰氏阴性菌污染的主要问题之一是内毒素
革兰氏阴性球菌：
在医学上是与人类有关的。
它们包括引起性传播疾病(淋病奈瑟氏菌、脑膜炎奈瑟氏菌)和呼吸道感染(卡他莫拉菌)的微生物。
这类的污染很少出现在生物工艺中。
如果结果显示有革兰氏阴性球菌污染，很有可能是检验错误。
革兰氏阴性螺旋菌：
在制药用水系统或洁净室环境很少发现。
这些细菌与排泄物污染有关,包括被污染的水源。
当检测到该类菌时，应该全面调查找到它的潜在来源。
细菌的鉴定流程图
生理生化--半自动细菌鉴定仪（ATB New）
检测项目：可鉴定由环境、原料及制成品分离出的菌种和药敏试验（包括：肠杆菌、非发酵G-杆菌、葡萄球菌、链球菌、酵母菌、厌氧菌）。可鉴定770种细菌和分析近80种抗生素药敏实验。
细菌的鉴定流程图
分子生物学--具体流程
系统发育树
3）真菌的鉴定
真菌的鉴定流程图
真菌形态观察
通常把真菌分为酵母菌和丝状真菌(霉菌)。
霉菌由粗大、有隔或无隔分支状菌丝构成，菌丝分为基质菌丝和气生菌丝。气生菌丝特化结构上产生多种无性、有性孢子。孢子着生部位、排列方式以及孢子形态是真菌鉴定的重要依据。
常见酵母菌污染来源
酵母菌是微小的单细胞真菌。
可能在非专业人员看来，平皿上的酵母菌落像细菌。然而，在显微镜下，这些细胞大得多，看起来像葡萄干，因此可以很容易地区别于细菌。
生物工艺中典型的酵母污染是生物工艺中的人员、植物和原材料。
常见霉菌污染来源
霉菌是多细胞真菌，其产生的细丝称为菌丝。因此其学名为“丝状真菌”。
这类微生物在土壤、尘埃(粉尘)和植被中非常常见。
霉菌污染是这些微生物在生殖周期中会产生的孢子。因此霉菌污染很容易传播。
另一个问题是大多数物种产生的真菌毒素对人类有害。
曲霉：分生孢子头
根霉：孢子囊、匍匐枝和假根
犁头霉：接合孢子
酵母菌：出芽
真菌的鉴定流程图
分子生物学在真菌鉴定中的应用
现行国标仅能够对曲霉属，青霉属，镰刀菌属等少数几个种属的霉菌进行鉴定。
我国的食品卫生微生物学检验国家标准中，对于青霉菌的鉴定需要在分离纯化后培养12-14天，再对其孢子及菌丝进行形态学观察。
真菌孢子易于在空气中飘散，难以杀灭，对实验室环境和检验人员安全具有潜在污染风险。
分子生物学鉴定技术不需要使用选择性培养基，纯化后即可进行菌种鉴定。对真菌的菌丝体和孢子均能够进行DNA的提取，避免霉菌产生的大量孢子对实验室工作环境带来的潜在污染危害。
5、污染菌库数据的处理与应用
目的：建立环境微生物污染趋势分析图，预测微生物污染方向，从被动的排查污染措施上升到主动的预防、预警。并将污染信息与历史污染物比对，回顾调查，帮助质量体系的改进。
作用：企业微生物污染的监督、管理和风险评估新模式的建立
环境监测计划→收集、分离、鉴别污染菌→数据分析与应用
沉降菌监测频次及测试状态
浮游菌监测频次及测试状态
表面微生物擦拭频次
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