作者：张宇 张曦木
通信作者：张宇
作者单位：Division of Engineering in Medicine, Department of Medicine, Brigham and Women′s Hospital, Harvard Medical School, MA 02139, U S A （张宇）；重庆医科大学附属口腔医院 口腔疾病与生物医学重庆市重点实验室 重庆市高校市级口腔生物医学工程重点实验室（张曦木）
引用本文：张宇, 张曦木. 三维生物打印在口腔软组织组织工程中的应用[J]. 中华口腔医学杂志, 2021, 56(7): 613-619. DOI: 10.3760/cma.j.cn112144-20210610-00290.
口腔软组织既包括口腔特有的牙髓、牙周膜、牙龈、口腔黏膜和唾液腺，也包括颌面部皮肤、血管、肌肉和神经，具备组织构成多、功能复杂、美学要求高、修复困难等特点。组织工程技术于1993年被提出［1］，过去30年间经历长足发展。随着一系列生物制造技术的问世，体外制备人体组织和器官进步较快。但传统生物制造技术大多基于手动或半自动操作，存在通量低、重复性差等问题。
三维生物打印是利用可荷载细胞或相关生物活性剂的生物墨水实现精确分配和构建复杂功能性三维组织或人工器官的制造技术［2］。三维生物打印作为组织工程和再生医学的一种新兴方法，具有可自动化操作和高通量的优势，可满足日益增长的工程化或移植组织器官的需求，为高效解决制备功能化人体组织的难题提供了新思路，也为修复口腔软组织缺损提供了广阔的潜在应用空间。
三维打印技术在1986年便已问世［3］，但直到21世纪初，生物打印才被逐渐报道，比如挤出式生物打印、喷墨式生物打印以及光固化生物打印等［4, 5, 6, 7］。近年生物打印的概念被明确定义为“使用计算机辅助、对具有特定二维或三维组织的活体和非活体材料进行图案化和组装的过程，以生产用于再生医学、药代动力学和基础细胞生物学等研究的生物工程化结构”［8］。本文所讨论的三维生物打印则将范围进一步缩小为以细胞相容性水凝胶为生物墨水的三维打印，该生物墨水通常包裹活细胞或能被用以荷载活细胞。经过20年的发展，目前主流的三维生物打印技术包括以下几类（图1）［2］。
图1 主要的三维生物打印技术［2］ A：喷墨式生物打印；B：挤出式生物打印；C：光固化或数字光处理生物打印；D：激光诱导向前转移生物打印
1.喷墨式生物打印：喷墨式生物打印的工作原理类似传统喷墨式打印机，仅需将传统墨水替换为生物墨水，即可实现简单的生物打印（图1A）。喷墨式生物打印在喷嘴附近使用加热或压电方式产生瞬时高压，将生物墨水以微小液滴的形式从喷嘴处挤出，在基底上形成二维或三维图案［9］。
喷墨式生物打印的设备相对简单，打印精度和速度均较高，但必须使用黏度较低的生物墨水，较低的细胞包载浓度使其应用存在一定的局限性。尽管近期部分技术性突破使喷墨式三维生物打印成为可能，但传统喷墨式生物打印仍较难打印三维图案［10, 11］。
2.挤出式生物打印：挤出式生物打印是目前使用最广泛的生物打印模式。挤出式生物打印通过气动或机械压力将生物墨水以微纤维的形式从喷嘴处挤出（图1B），在基底上形成二维或三维图案［12］。
挤出式生物打印的设备相对简单。但与喷墨式生物打印相反，挤出式生物打印需要黏度较高的生物墨水以保证打印图案的稳定，其缺点包括相对较低的分辨率以及挤压过程对细胞活性的影响，该缺点可通过近期报道的部分新方法，如收缩生物打印以及通过使用剪切力稀化的生物墨水改良［13, 14］。同时，诸如牺牲式生物打印、嵌入式生物打印和微流控生物打印的出现也扩展了挤出式生物打印的应用范围［13， 15, 16, 17］。
3.光固化或数字光处理生物打印：1986年报道的光固化打印是最早的三维打印模式［3］，但近20年后才被用于生物打印［7］。主要原因为光固化生物打印设备较喷墨式和挤出式生物打印更复杂。传统光固化模式使用激光进行逐行图案化扫描以逐层交联光敏生物墨水，而后期的数字光处理固化模式不再使用激光并采用整面图案化的逐层交联（图1C），有效简化了打印系统并提升打印速度［18, 19］。
光固化或数字光处理生物打印的优势在于其能以较高的精度制备空间结构较复杂的三维生物组织，尤其是与最新的连续液面生产方法结合更具速度优势［20, 21］。缺点是除设备复杂外，还对生物墨水的黏度和光敏性等性能有较高要求。传统光固化或数字光处理生物打印交联使用的紫外线对细胞活性的影响亦可通过最近报道的可见光引发剂解决［22, 23］。
4.激光诱导向前转移生物打印：激光诱导向前转移生物打印于2004年左右被首次报道后［24］，开始逐步应用推广。但因该方法技术难度较高，应用范围远低于前述3种生物打印模式。激光诱导向前转移生物打印的原理是将生物墨水层涂覆于吸收层下，通过聚焦脉冲激光在吸收层上引起照射位置的生物墨水层局部气化并被挤离吸收层，实现在接收基底上的图案化（图1D）。
激光诱导向前转移生物打印精度较好（数微米至数十微米），但对生物墨水性能的要求也较高。与喷墨式生物打印机类似，激光诱导向前转移生物打印较难构建三维结构且前者造价远高于后者。
5.其他三维生物打印技术：除以上4种常见技术外，双光子光聚合、双光子光降解或消融以及最近发展的旋转光固化等技术也被用于三维生物打印［25, 26, 27, 28, 29］。
虽然传统三维生物打印拥有精度较高、结构较精细的优势，但其笨重的设备和较差的时效性常无法满足临床需求。如传统三维生物打印需提前制作组织或器官的外形模型，再由生物打印机进行打印和打印后培养，耗时较长。2012年，一种机械臂术中生物打印设备问世，早期用于皮肤组织的原位修复［30, 31］，随后被拓展为更复杂的内脏和颌面部等组织的原位重建［32, 33］，打印技术也从早期的挤出式发展为近期的数字光处理和双光子聚合等［30， 32, 33, 34, 35, 36］。
2016年，手持式原位生物打印机开始兴起［37］。相较于机械臂原位生物打印设备，手持式生物打印设备拥有独特的轻便性和更小的体积，一经问世即在关节、骨及骨骼肌等皮肤以外组织的原位生物打印和修复中得到广泛应用［37］。最近一种手持式喷墨式生物打印机通过装载包裹有牙髓细胞和内皮细胞的基于Ⅰ型胶原/海藻酸的生物墨水，实现了对原位牙髓组织的生物打印（图2），并证实其血管化能力［38］。
图2 原位三维生物打印方法在口腔组织修复中的应用
生物墨水在生物打印技术中的作用至关重要，其可实现生物打印过程、保持荷载的细胞和其他生物活性因子的活性、维持打印后结构以及诱导细胞和组织功能化等［19，39, 40］。
常见的细胞相容性水凝胶生物墨水来源可分为天然生物材料和合成生物材料，前者如胶原、明胶、丝素蛋白、透明质酸、海藻酸及其衍生物等，后者如聚乙二醇及其衍生物等。近年，脱细胞基质材料在生物打印领域也日益受到关注［41］。多组分和复合生物墨水亦能提高其可打印性和生物活性［42, 43］。
值得注意的是，不仅不同细胞对不同生物墨水反应不同，不同打印方法亦可对生物墨水产生不同要求。以明胶为例，其具有温敏的相变特性，低温时为凝胶状态。因此，凝胶状的明胶生物墨水适合挤出式生物打印，但简单的物理交联不足以维持打印结构的长期稳定性，故仍需二级交联（通常为化学交联或酶交联）。由于未改性明胶的交联方法有限，其一系列衍生物应运而生，包括甲基丙烯酰化明胶（gelatin methacryloyl，GelMA）、降冰片烯化明胶、烯丙基化明胶等。相比于未改性明胶，这些带特定官能团的明胶衍生物可通过有效、简单并可控的化学交联（包括光交联）提高打印图案的稳定性。而对于光固化或数字光处理生物打印，因需用黏度较低的液态生物墨水，若使用明胶或其衍生物，则生物墨水不能起始于低温凝胶状态。
1.牙髓三维生物打印：牙髓是口腔特有软组织三维生物打印研究中最成熟的组织。目前文献报道的牙髓三维生物打印几乎全部使用挤出式生物打印技术，使用的生物墨水材料包括明胶-海藻酸钠、GelMA和脱细胞基质等［44, 45, 46, 47, 48, 49］。多数包载细胞为牙髓细胞或牙髓干细胞，也有少量包载成牙本质细胞和根尖牙乳头干细胞的报道［50］。
目前，三维生物打印的牙髓已可实现向神经、血管和成牙本质样细胞方向分化。2018年Xuan等［51］利用自体乳牙牙髓干细胞聚集体实现人原位牙髓功能再生。能否利用单一或多样的异体干细胞结合更优的生物墨水，实现单细胞/细胞球/细胞聚集体的混合或分层打印将是三维生物打印在牙髓再生流程化应用中的发展方向。
2.牙周膜三维生物打印：牙周组织再生和牙髓再生是口腔组织工程的两大重点。牙周再生目前临床和动物实验多以牙槽骨再生为主，而三维生物打印尚停留在实验室阶段，涉及的生物墨水除纤维蛋白原-明胶-透明质酸-甘油外［52］，也可添加纳米羟基磷灰石等成骨性功能材料，如使用海藻酸-明胶-纳米羟基磷灰石复合生物墨水包载牙周膜细胞用于挤出式生物打印和牙槽骨再生［53］。
因为骨组织工程中三维打印或生物打印技术研究较广泛，实现牙周缺损的单纯骨再生并不困难，但有功能的牙周膜重建是牙周组织再生的难点。牙周膜涉及胶原纤维在牙槽骨及牙骨质中的有序排列。其中，仅数百微米的牙周膜间隙对牙周膜的生物打印精度提出不小的挑战。目前， 牙周膜的三维生物打印多为利用不同的生物墨水、打印方法以及打印参数等模拟牙周细胞外基质结构，包载牙周膜细胞的体外研究。例如，利用微阵列喷墨式生物打印技术制备的GelMA/聚乙二醇水凝胶可荷载人牙周膜细胞用于筛查细胞与细胞外基质间的相互作用［54］。Thattaruparambil等［55］系统测试了挤出式生物打印方法结合GelMA水凝胶对其中包裹的牙周膜细胞的影响，筛选最优打印参数。
无论是牙周骨再生，还是包载牙周膜细胞的生物水凝胶打印，目前均较难在现有打印精度下实现原位牙周膜纤维穿插入牙槽骨和牙骨质的有序结构。虽然类似软硬界面连接的骨-韧带三维生物打印可为模拟该有序结构提供参考［56］，但目前微米级打印精度仍较难实现牙周组织如此复杂的微尺寸和多级结构的制备。或许纯细胞/细胞球的无支架材料打印结合细胞自组装、放弃结构模拟是一种可能的后续方向。
3.皮肤、牙龈、口腔黏膜三维生物打印：目前，尚未见三维生物打印修复牙龈和口腔黏膜等其他软组织的研究。作为口腔特有软组织，牙龈和口腔黏膜的多层层状结构与皮肤类似，故可参考皮肤三维生物打印及其他黏膜或上皮组织的生物打印［57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64］。口腔的特殊环境，包括湿润性、咀嚼压力、较小的操作空间以及不易包扎等可能是研究受限的原因。
4.唾液腺三维生物打印：功能腺体再生的关键是形成有功能的腺泡单位。虽然包载干细胞的生物打印可较好模拟腺体发育过程中的腺泡单位结构，在功能化腺体再生中应用的前景巨大。但目前唾液腺方面仅可见Urkasemsin等［65］利用磁性纳米颗粒标记唾液腺干细胞实现有神经反应性的唾液腺样上皮类器官结构的三维生物打印。后续研究可参考胰腺、胃腺等消化腺和汗腺的三维生物打印或组织工程方法。
5.血管、神经和肌肉的三维生物打印：口腔软组织还包括血管、神经以及肌肉等组织。血管的三维生物打印已被广泛报道［66］，主要方法有牺牲式生物打印、微流控生物打印等，前者可提供较复杂的微血管网络，后者可形成独立性较强的小血管结构，这些方法均可为口腔软组织血管化工程所用。
神经组织的三维生物打印对生物墨水及打印参数的要求较高，以保护较敏感的神经细胞的活性，并实现神经细胞或轴突的定向化伸展，是神经功能化的重要指标［67］。目前针对口腔神经组织的三维生物打印研究有限；近期，Zhang等［68］使用牙龈间充质干细胞球进行三维生物打印，用于修复大鼠面神经缺损，并获得一定成功，或可作为未来口腔软组织神经化工程的参考。
虽然肌肉的三维生物打印方法也较成熟，但以大肌群为主，主要考虑因素为如何实现肌肉细胞多级结构的定向化排列［69］。口腔肌肉主要包括咬肌、口轮匝肌、颊肌以及其他小型肌群。合理引入血管和神经的共打印对肌肉组织的功能化有较重要的意义。
三维生物打印在模拟软组织形状、内部结构、厚度、体积、力学性能方面具有无可比拟的优势。同时，数字化的三维生物打印技术可允许应用数字化工作流程，从而为患者量身定制移植物。在此过程中需要解决如下问题：合适的图像采集技术，选择相应的生物墨水和细胞来源，以及合适的三维生物打印技术、设备和参数等。
口腔软组织结构精细复杂，操作空间有限，不仅涉及功能，还与美观密切相关。原位生物打印可直接在伤口处实现细胞和细胞外基质在三维空间上的有序结构构建，有效减少一些不必要的步骤，可节约时间、同时降低组织感染的概率。其中，与人工智能结合的术中机械臂生物打印更可最大化避免患者术中微动对打印精确度的影响［70］。尽管原位生物打印方法目前在口腔中的应用还较有限，但该类新技术为未来包括牙髓、牙周膜、牙龈和口腔黏膜等各种软组织的原位修复提供了可能。
通过自动化控制的三维生物打印技术将相关细胞和细胞外基质精细排列形成组织和器官结构，在再生医学包括口腔软组织再生中有巨大潜力。但鉴于口腔特殊的环境，开发更小巧的生物打印设备和更简便的生物打印方法、可在口腔湿润环境中打印的生物墨水以及提高生物打印精度以适应口腔软组织的复杂结构和功能，将是未来的研究重点。
利益冲突 所有作者均声明不存在利益冲突
作者贡献声明 张宇：收集资料、文章撰写和修改；张曦木：收集资料、文章撰写
（参考文献略）
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