研究背景
DSB通过同源定向修复（HDR）或非同源链末端连接（NHEJ）的方式进行修复。HDR是是以姐妹染色单体或外源供体DNA为模板进行修复。但是由于HDR不是人的体细胞修复DNA损伤的主要修复途径，所以外源DNA插入DSB位点的效率很低。细胞修复DSB的主要方式是NHEJ，该途径会产生indel突变。
本文作者制订了一个精确而有效的基因校正策略。研究者通过在供体质粒和靶向基因上各自引入一个nick，在保证准确基因编辑的同时，大大降低了可能导致基因组不稳定的因素。
实验思路
1、在mCherry-P2A-EGFP报告细胞系（EGFP含无义突变）中探讨靶向EGFP同一条链的双sgRNA引起的TN（Tandom Nick）是否能够促进有效的基因编辑。
2、探讨当供体质粒骨架上存在SN（Single Nick）时是否促进靶向基因组EGFP的单个sgRNA产生的SN引起的的基因编辑。
3、对比SNGD(SNs in the target gene and donor plasmid)与Cas9诱导的DSB介导的基因编辑效率。
4、探讨修复模板的长度对SNGD介导的基因编辑的影响及修复模板中整合进基因组的DNA序列范围。
5、探讨与HDR相关的因子是否参与了SN介导的基因编辑过程。
6、应用实例：用SNGD介导的基因编辑校正TSCERS细胞中发生1bp插入突变的内源基因TK1。
实验结果
1、基因组 DNA上的TN（Tandom nick）可诱导有效的基因编辑。（A）将带有c.321C>G:
p.Y107∗ EGFP 突变的mCherry-P2A-EGFP 报告基因整合到293T细胞的基因组。由于EGFP发生了无义突变，细胞不表达EGFP，但表达mCherry。当含有EGFP修复序列（4-720bp）的donor DNA把c.321C还原成G时，EGFP表达。（B）设计3条靶向EGFP正义链的sgRNA。（C）构建一系列修复模板供体质粒。（D）基因组DNA上产生TN时，细胞恢复表达EGFP。当供体质粒也被切割产生nick时，TN的引起的编辑效率与两个sgRNA靶向位置的距离远近无关。
2、基因组和供体质粒上的SN（Single nick）可以促进有效的核苷酸替代。（A）设计7条靶向供体质粒pUC57骨架的sgRNA。（B）7条sgUC57s分别与sgEGFP332s共转，均能引起EGFPcC>G reporter中核苷酸的有效替换。且SNGD的碱基替换效率。（C）供体质粒中的SN无论在哪条链上都可以促进SNGD介导的基因编辑。（D）将靶向EGFcC>G reporter的sgRNA在供体质粒上对应的PAM进行突变后，SNGD引起了14.2%的碱基替换。DSB对应的碱基替换效率比SNGD低了2%。
3、SNGD比Cas9诱导DSB介导的报告基因编辑更精确。（A）构建报告细胞系：同时整合了 mCherry-P2A-EGFP c.321C>G 和tagBFP-P2A-EGFP c.321C>G 。在每个报告基因sgRNA靶向的位置引入nick或DSB。将带有nick质粒且PAM被无义突变的供体质粒和靶向报告基因的sgRNA共转染进细胞。筛选EGFP阳性的单克隆细胞并进行DNA序列分析。（B）在EGFP阳性的单克隆细胞中，WT-Cas9引起的indels高达92.3%，而SNGD引起的indels却只有3.57%。SNGD对应的编辑效率为14.3%，而DSB对应的效率为5.77%。（C和D）经过三次的重复转染，SNGD使得EGFP细胞的阳性率高达34%，第四次转染后可高达41%。（E）经过三次的重复转染后，筛选EGFP阳性单克隆细胞，进行序列分析，正确编辑效率高达37.5%。
4、SNGD介导的基因编辑中靶基因整合修复模板的长DNA序列。（A）不同长度的修复模板示意图。（B和C）不同修复模板的碱基替换效率。（D）在修复模板中引入4或17个碱基的突变。（E）降低EGFPcC>G reporter和供体序列间的同源性会抑制SNGD介导的基因编辑。
5、非典型HDR促进SNGD介导的基因编辑。（A和B）在报告细胞株中Knockdown CtIP、BRCA2或 RAD51，会抑制DSB诱导的碱基替换。（C）Knockdown BRCA2或 RAD51 显著抑制SN介导的碱基替换。（D）Knockdown CtIP不会抑制SN介导的碱基替换。（E）Knockdown CtIP对SNGD介导的碱基替换无影响。（F）Knockdown RAD51 促进SNGD介导的碱基替换。（G）Knockdown RAD52 不会抑制SNGD介导的碱基替换。
6、通过SNGD介导的基因编辑可精确地校正胸苷激酶1基因（TK1）。（A）设计靶向TK1且包含TK1 exon4 1-bp insertion的sgRNA。（B）带有TK1突变的TSCER2细胞对CHAT培养基敏感。将sgRNA与 Cas9D10A/Cas9-P2A-GFP共转TSCER2细胞，筛选GFP阳性的单克隆细胞，用CHAT培养基进行培养扩增。经过DSB和SNGD介导的基因编辑处理，对CHAT培养基产生抗性细胞百分比分别为45%和9.6%。（C）经测序分析，在SNGD介导产生的对CHAT培养基敏感的单克隆细胞株中，TK1序列被正确校正的比例为92/92，而DSB对应的比例为18/92。
研究意义
该方法可以纠正任何核苷酸的转换。精准Cas9系统可能以一种更有效、精准的方式治疗一系列疾病。SNGD介导的精准基因编辑将使得基因修复过程更加的安全。
原文摘要
CRISPR/Cas9, which generates DNA double-strand breaks (DSBs) at target loci, is a powerful tool for editing genomes when codelivered with a donor DNA template. However, DSBs, which are the most deleterious type of DNA damage, often result in unintended nucleotide insertions/deletions (indels) via mutagenic nonhomologous end joining. We developed a strategy for precise gene editing that does not generate DSBs. We show that a combination of single nicks in the target gene and donor plasmid (SNGD) using Cas9D10A nickase promotes efficient nucleotide substitution by gene editing. Nicking the target gene alone did not facilitate efficient gene editing. However, an additional nick in the donor plasmid backbone markedly improved the gene-editing efficiency. SNGD-mediated gene editing led to a markedly lower indel frequency than that by the DSB-mediated approach. We also show that SNGD promotes gene editing at endogenous loci in human cells. Mechanistically, SNGD-mediated gene editing requires long-sequence homology between the target gene and repair template, but does not require CtIP, RAD51, or RAD52. Thus, it is considered that noncanonical homology-directed repair regulates the SNGD-mediated gene editing. In summary, SNGD promotes precise and efficient gene editing and may be a promising strategy for the development of a novel gene therapy approach.
Nakajima K, Zhou Y, Tomita A, et al. Precise and efficient nucleotide substitution near genomic nick via noncanonical homology-directed repair.[J]. Genome Research, 2017.
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