研究表明，抗氧化是预防衰老的重要机制。自由基或氧化剂会将细胞和组织分解，影响代谢功能，并会引起不同的健康问题。如果能够消除过多的氧化自由基，对于自由基引起的相关疾病都能够预防。
《酵素产品分类导则》中将酵素定义为以动物、植物、菌类等为原料，添加或不添加辅料，经微生物发酵制得的含有特定生物活性成分的产品。食用酵素富含多种非酶生物活性成分（一般包括多酚类、多糖类、多肽类等），以及多种酶类活性物质（抗氧化的SOD、CAT酶等），这些物质具有显著抗氧化活性作用。周颖等以生姜作为发酵原料，通过加入酵母菌、副干酪乳酸菌、醋酸杆菌（沪酿1.01）复合菌制备生姜酵素，定期取样测定生姜发酵过程中的6-姜酚、姜辣素、总酚及黄酮含量和DPPH自由基清除率，结果表明生姜酵素发酵过程中抗氧化活性较好。林冰等研究表明刺梨酵素的总抗氧化能力较强，且对DPPH自由基及ABTS自由基的抑制能力极好。但以菊花为原料制作的酵素其抗氧化活性至今还没有得到研究。
亳菊是安徽的道地药材，其富含抗氧化成分多酚等多种活性成分，如花色素、绿原酸、菊苷、菊花萜二醇等，是国家卫健委公布的药食同源植物，其是制作高抗氧化植物发酵功能食品酵素理想原料。为此，本研究以亳菊为原料，通过优化发酵条件以提升其抗氧化活性，为获得高质量的酵素饮品提供理论指导。
01
材料和方法
1.1 材料
巴氏醋酸菌AS1.41（购于上海保藏生物技术中心）、酵母菌（安琪酵母股份有限公司）、双歧杆菌7菌型（北京川秀国际贸易有限公司）。酵母粉、葡萄糖购于上海国药集团，亳菊购于亳州药材大市场。
培养基：酵母菌种子培养基：葡萄糖，10g/L；新鲜马铃薯，200g/L；
醋酸菌种子培养基：葡萄糖，10g/L；酵母粉，10g/L；pH=5.5
双歧杆菌7菌混合种子培养基：蛋白胨，10g/L；牛肉，10g/L；酵母粉，5g/L；磷酸氢二钾，2g/L；柠檬酸二铵，2g/L；乙酸钠，5g/L；葡萄糖，20g/L；吐温80,1g/L；硫酸镁，0.5g/L；硫酸锰，0.25g/L；pH=6.2。
1.2 实验方法
1.2.1 酵母菌和醋酸菌种子培养
分别将酵母菌和醋酸菌种子培养基按配方配制后进行高温灭菌，灭菌完成后将酵母菌和醋酸菌在无菌操作台上分别接种到已灭好菌的种子培养基，放入摇床30℃培养48h。
1.2.2 制备酵母菌菌泥和醋酸菌菌泥
分别将培养48h后的酵母菌种子液和醋酸菌种子液等量分装至离心管中在4000r/min下离心10min，弃其上清液保留底部沉淀，从而分别获得酵母菌菌泥、醋酸菌菌泥，加入40mL无菌水使其完全混匀，从而获得以下实验所添加的酵母菌菌液和醋酸菌菌液。
1.2.3 双歧杆菌等7菌混合种子培养
按照双歧杆菌7菌混合种子培养基配方配制后进行高温灭菌，灭菌完成后在无菌操作台中将菌粉2g接种到已灭菌的种子培养基中，放入37℃培养箱进行厌氧培养48h。
1.2.4 基本培养基的酵素发酵
用电子天平称取6g木糖和10g亳菊放入500mL锥形瓶中加水定容至300mL，再向其中加入酵母菌菌液2mL和醋酸菌菌液2mL，放入摇床中30℃好氧培养5天。好氧发酵结束后向其发酵液中加入双歧杆菌7菌混合菌液2mL，调至pH为6.0，然后37℃下密闭厌氧发酵5天。
1.2.5 单因素发酵试验
在基本发酵培养基基础上，每次改变一个条件，研究不同碳源、不同碳源浓度、料液比、pH值、发酵天数，对亳菊酵素DPPH抑制活性的影响。
1.2.6 正交试验
在单因素试验基础上，选取对酵素抗氧化活性影响较大的因素，即碳源浓度、发酵天数、pH值、料液比4个因素，采用4个因素3个水平设计正交试验，进一步优化酵素发酵条件。
1.3 DPPH抑制活性测定和计算方法
测定方法参考文献，并稍作修改。准确称取一定量的DPPH，用无水乙醇配制成0.04mg/mL的DPPH溶液，现配现用。由于水果酵素样品浓度较高，事先用纯水进行稀释配制成浓度为1%、3%、5%、7%、9%的样品溶液作为待测溶液做预实验，以清除率为30%～50%为佳。预实验结果选取1%浓度为佳。精确移取2mL不同浓度待测溶液，加入2mL DPPH溶液混合均匀后放置30min，即可用比色皿在分光光度计517nm处上测定光吸收值，并以2mL待测溶液加入2mL无水乙醇作为空白对照，每个浓度组平行测定3次，求平均值。总的DPPH光吸收值测定为2mL DPPH溶液加入2mL无水乙醇，空白对照用2mL纯水代替DPPH溶液，测得光吸收值A517。最后，按清除率计算公式计算样品溶液对DPPH自由基的清除能力。DPPH清除率公式为：K (%)=[1-A1/A0]*100%。其中，A1为2.0mL样品溶液+2.0mLDPPH溶液；A0为2.0mL无水乙醇+2.0mLDPPH溶液。然后以浓度为横轴，DPPH抑制活性为纵轴绘制直线，根据线性公式计算抑制率为50%时的IC50的值。
02
结果与分析
2.1 培养基成分对酵素产品DPPH抑制活性的影响
2.1.1 碳源种类及添加量对酵素产品DPPH抑制活性的影响
在以木糖为碳源基础发酵培养基中，改变碳源种类，分别以20g/L木糖、食品级蔗糖、葡萄糖、麦芽糖为碳源，将其放入摇床中30℃好氧培养5天。好氧发酵结束后添加双歧杆菌7菌液2mL，调至pH为中性，37℃下厌氧发酵5天。发酵完成后，测定酵素溶液1%、3%、5%、7%、9%浓度的DPPH值，并计算出IC50的值，结果见表1。由表1可知，以蔗糖作为碳源酵素产品的抗氧化活性最高（IC50为0.03397)。
表1 不同碳源对酵素产品的DPPH抑制活性影响
以蔗糖为碳源，分别添加20g/L、70g/L、115g/L、160g/L、205g/L的蔗糖，再向其加入酵母菌菌液和醋酸菌菌液2mL，然后放入摇床中30℃好氧培养5天。好氧发酵结束后，向其发酵液中加入双歧杆菌7菌型菌液2mL，调初始pH为7.0，37℃下厌氧发酵5天。发酵完成后，测定酵素溶液1%、3%、5%、7%、9%浓度的DPPH值，并计算出IC50值，结果见表2。由表2可知，以蔗糖浓度205g/L制备的酵素产品的抗氧化活性最高(IC50为0.0348)。
表2 不同碳源浓度对酵素产品的DPPH抑制活性影响
2.1.2 不同料液比对酵素产品DPPH抑制活性的影响
以蔗糖为碳源，改变菊花料液比（g/mL）分别为1:25,1:30,1:35,1:40,1:45，发酵前向其加入酵母菌菌液和醋酸菌菌液2mL，然后放入摇床中30℃好氧培养5天。好氧发酵结束后向其发酵液中加入双歧杆菌菌液2mL，调至pH为7.0，37℃下厌氧发酵5天。发酵完成后，测定酵素溶液1%、3%、5%、7%、9%浓度的DPPH值，并计算出IC50的值，结果见表3。由表3可知，以1:40为发酵料液比酵素产品的抗氧化活性最高（IC50为0.03529)。
表3 不同料液比对酵素产品的DPPH抑制活性影响
2.2 培养条件对酵素产品DPPH抑制活性的影响
2.2.1 不同初始pH值对酵素产品DPPH抑制活性的影响
以蔗糖为碳源，设定初始pH分别为4.5、5.0、5.5、6.0、6.5，发酵前向其加入酵母菌菌液和醋酸菌菌液2mL，然后放入摇床中30℃好氧培养5天。好氧发酵结束后向其发酵液中加入双歧杆菌菌液2mL，调至pH为4.5、5.0、5.5、6、6.5，37℃下厌氧发酵5天。发酵完成后，测定酵素溶液1%、3%、5%、7%、9%浓度的DPPH值，并计算出IC50的值，结果见表4。由表4可知，初始pH值为6.0时发酵所得到的酵素产品的抗氧化活性最高（IC50为0.03529)。
表4 不同pH对酵素产品的DPPH抑制活性影响
2.2.2 不同发酵天数对酵素产品DPPH抑制活性的影响
以蔗糖为碳源，改变总发酵天数分别为6天、8天、10天、12天、14天，发酵前向其加入酵母菌和醋酸菌菌液2mL，然后放入摇床中30℃好氧培养1天、3天、5天、7天和9天。好氧发酵结束后向其发酵液中加入双歧杆菌菌液2mL，调至pH为6,37℃下厌氧发酵5天。发酵完成后，测定酵素溶液1%、3%、5%、7%、9%浓度的DPPH值，并计算出IC50的值，结果见表5。由表5可知，以10天为发酵时间酵素产品的抗氧化活性最高（IC50为0.03529)。
表5 不同发酵时间对酵素产品的DPPH抑制活性影响
2.3 发酵条件正交试验设计和结果
在单因素试验的基础上，采用4因素3水平的正交表设计正交试验进行发酵，发酵完成后测定酵素溶液1%、3%、5%、7%、9%浓度的DPPH值，并由此计算出IC50的值，从而进一步优化酵素发酵条件，正交试验结果见表6。结果表明，糖浓度为205g/L(A3)，pH为6.5(B3），发酵天数为12天（C3），菊花料液比为1g∶40mL(D2）可以获得最高DPPH抑制活性的酵素产品。由于最优组合不在正交表中，重新试验所获得酵素液DPPH抑制活性IC50值为0.0342，未优化对照以木糖为碳源其DPPH抑制活性IC50值为0.0569，较对照提高了60.08%。进一步方差分析表明选取的4个因素对DPPH抑制活性IC50值影响并不显著。
表6 培养条件的正交试验设计和IC50的值
3 结束语
本研究对菊花酵素产品发酵条件进行了优化，通过单因素和正交试验，确定了最佳的发酵条件为：蔗糖浓度为205g/L，菊花料液比为1:40(g/mL），初始pH为6.5，发酵天数为12天。在此条件下，发酵前分别加入酵母菌菌液和醋酸菌菌液2mL，然后放入摇床中30℃好氧培养6天。好氧培养结束后向其发酵液中加入制备的双歧杆菌七菌型混合菌液2mL，调至pH为6.0，37℃下密闭厌氧发酵6天。在最适发酵条件下进行3批试验，测其抗氧化活性（DPPH抑制活性）计算IC50的值为0.0342，相对未发酵前提高了60.08%。进一步发现发酵过程中影响DPPH抑制活性最为明显的是碳源种类，其他因素影响较小。这些研究结果为酵素高抗氧化功能生产提供了理论基础。
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