徐 源1，李凯迪1，邴钟兴1，郭 超1，梁乃新1，潘 慧2，李单青1
中国医学科学院 北京协和医学院 北京协和医院1胸外科2内分泌科，北京100730
通信作者:梁乃新 电话:010-69154804，E-mail:pumchnelson@163．com
【关键词】双调蛋白;肿瘤;发生;进展
人类双调蛋白是一个含有84个氨基酸的糖蛋白，最早于1980年由Shoyab从人乳腺癌细胞中发现并分离出来［1］。双调蛋白作为表皮生长因子受体 (epidermal growth factor receptor，EGFR)的配体，在多种组织和器官中表达，并通过维持肿瘤细胞生长信号的自给自足、抑制肿瘤细胞凋亡、帮助肿瘤细胞获得无限复制潜能、维持血管生成、参与Warburg效应、促进肿瘤组织侵袭和转移以及参与肿瘤治疗抵抗等效应，参与肿瘤的发生和进展。本文对人类双调蛋白在肿瘤发生和进展中的作用进行综述。
人类双调蛋白基因位于4号染色体q13～q21区域，由6个外显子组成，可合成一个由252个氨基酸组成的跨膜双调蛋白前体。在蛋白酶作用下，双调蛋白前体的胞外域被水解切割，释放出可溶的双调蛋白，称为双调蛋白的解离 (Shedding)。根据细胞种类和所处微环境的不同，双调蛋白可从双调蛋白前体的不同位点剪切，这一过程受肿瘤坏死因子-α转化酶(tumor necrosis factor-α converting enzyme，TACE)调节。
双调蛋白在多种正常组织和器官中表达，包括泌尿生殖系统 (乳腺、子宫、卵巢、胎盘、肾、前列腺)，循环系统 (血管壁、骨髓、血液、淋巴)，呼吸系统 (气管、肺)，消化系统 (食管、脾、胃、小肠、结肠)及内分泌系统 (胰腺)等。近年来发现双调蛋白在初乳和健康人群的血清中亦有表达［2］。
双调蛋白参与了一系列生理过程，包括女性生殖系统发育、精子发生、胚胎着床，肺、肾和前列腺的分支形态发生，神经元发育、轴突生长、角化细胞增殖，骨组织发育、骨质形成和免疫功能的维持等。
经过二十多年的研究，人们发现双调蛋白主要作为致癌因子起作用。在人类多种肿瘤组织中发现了双调蛋白的过表达，但机制并不明确。在细胞中，双调蛋白涉及一系列肿瘤发生和进展过程，如生长信号的自给自足、组织侵袭、抑制凋亡等。
双调蛋白与生长信号的自给自足
一些对双调蛋白敏感的肿瘤细胞可以募集自身生长因子，通过分泌双调蛋白降低对周围正常微环境的依赖，从而形成自分泌环。研究表明，人乳腺癌细胞中双调蛋白的介导不依赖于EGF，过表达双调蛋白的细胞甚至可以在无血清条件下生存［3］。关于肝癌细胞系和肺癌细胞系的研究表明，置于无血清条件下时，双调蛋白的分泌会增加，提示双调蛋白是这些细胞的典型生存因子，且参与生长信号的自给自足［4］。在肝癌、肺癌和结肠癌细胞中抑制双调蛋白的表达，将抑制细胞生长［4-5］。
双调蛋白本身可促进双调蛋白基因的表达，这一结论在肝癌细胞系、结肠转移癌、KM12和血管平滑肌细胞系中被证实，提示双调蛋白的产生存在一个正反馈环［4］。对乳腺癌、结肠癌和胰腺癌的研究均表明，这些肿瘤中存在双调蛋白自调控反馈环。与原始乳腺癌细胞相似的是，双调蛋白仅在肿瘤上皮表达，但在基质和炎症细胞中不表达。阻断EGFR配体，可以强烈抑制EGFR自分泌的激活，降低肿瘤细胞转移的速度和几率。乳腺癌中，双调蛋白的自分泌环主要依赖于双调蛋白的解离，此外，在乳腺上皮细胞中，溶解的双调蛋白较膜固定的双调蛋白有更强的促细胞分裂作用。还有研究表明，双调蛋白的C端片段对维持体外角化细胞的自分泌起重要作用［6］。
过度分泌双调蛋白的细胞还可通过旁分泌维持周围细胞的生长。体外研究表明，在多种旁分泌因子中，双调蛋白的基因表达在细胞外显著升高。此外，由于双调蛋白在血清中的浓度可测，因此也被认为是一个内源性的生长因子［7］。
外泌体 (exosomes)是一种新发现的细胞内信号传导系统。在结肠癌细胞的研究中发现，细胞内外来子中存在双调蛋白，且其通过激活EGFR启动了介导细胞侵袭的作用［8］。
因此，肿瘤细胞中，双调蛋白通过自分泌激活下游信号;在微环境中，双调蛋白通过自分泌和旁分泌传导信号;在健康组织中，通过内分泌信号进入系统循环。据此可认为双调蛋白是一种多分泌途径信号蛋白。
双调蛋白抑制肿瘤细胞的凋亡
肿瘤细胞可通过多种机制抵抗凋亡，如过表达抗凋亡分子如Bcl-2、Bcl-xl，灭活促凋亡分子如Bax、Bad，阻断Fas信号通路以及p53的失活等。一些研究表明，双调蛋白是一种抗凋亡信号分子。在肺腺癌细胞系中，双调蛋白与类胰岛素样生长因子-1(insulinlike growth factor-1，IGF-1)协同抑制血清饥饿疗法诱导的细胞凋亡［9］。在非小细胞肺癌细胞系中的研究认为，双调蛋白通过一个不依赖PI3K/MAPK、但依赖蛋白激酶C的通路，灭活促凋亡蛋白Bad和Bax，从而抑制细胞凋亡［10］。在肝细胞肝癌中，双调蛋白的下调将促进 BIM蛋白的表达，升高转化生长因子-β (transforming growth factor-β，TGF-β)，从而诱导细胞凋亡［4］。乳腺癌细胞中双调蛋白亦展现出抗凋亡特性，使p53、p21表达下调，Bcl-2水平升高［11］。在胶质瘤细胞中，双调蛋白参与抑制大麻素介导的凋亡［12］。小鼠肝脏中几乎不表达双调蛋白，但加入外源性双调蛋白可阻断Fas介导的肝损伤，且双调蛋白对胚胎的原始肝细胞具有直接的抗凋亡作用，这一作用与AKT、STAT-3、Bcl-xl等信号通路有关［13］。对一例因长期接触六价铬而患肺癌工人的研究发现，六价铬通过促进双调蛋白的表达，从而抑制Bax、Bcl-2和Bcl-xl的表达，最终抑制细胞凋亡，导致肿瘤的发生，这一过程亦与PI3K/AKT通路有关［14］。
双调蛋白与肿瘤细胞的无限复制潜能
几乎所有恶性肿瘤细胞都可通过增强端粒酶活性或其它机制来保持细胞的端粒长度。在角质细胞模型中，双调蛋白参与了细胞获得无限复制潜能的过程。上皮细胞中，在培养基中撤除双调蛋白将降低端粒酶活性，提示双调蛋白对维持端粒酶活性和促进无限复制起重要作用［15］。
双调蛋白参与维持血管生成
肿瘤生长时，大多会经历严重缺氧的微环境，并分泌因子促进血管生长。细胞对缺氧的适应性反应主要由缺氧诱导的转录因子 (hypoxia-inducible transcription factor，HIF)介导，且多种HIF靶基因参与了肿瘤的侵袭。血管内皮生长因子 (vascular endothelial growth factor，VEGF)是研究最多的HIF。对乳腺癌模型的研究认为，双调蛋白受HIF-2调控［16］。研究发现，双调蛋白的血管生成活性受肿瘤抑制剂脯氨酰-4-羟化酶 2(prolyl-4-hydroxylase domain enzyme 2，PHD2)负调控，而PHD2可维持HIF-α稳定，且后者参与了肿瘤侵袭和血管生成。对转染的人类乳腺细胞的研究发现，沉默双调蛋白将抑制肿瘤血管生长，并抑制TGF-β1的表达，提示双调蛋白与这些细胞的血管生成有关［17］。
研究表明，双调蛋白对血管平滑肌细胞有促分裂作用，中和抗体拮抗双调蛋白，将抑制上皮细胞形成新生血管［16］。此外，HOXB9表达的升高，将介导双调蛋白和多种血管生成因子如VEGF和碱性成纤维细胞生长因子 (basic fibroblast growth factor，bFGF)的上调，前列腺素E2也可介导双调蛋白和VEGF-A的过表达，提示双调蛋白和促血管生成因子有共同的调节剂［18］。
氧气对双调蛋白的调节作用尚不明确。支气管发育不良模型中，高氧可促进双调蛋白的分泌。肠上皮细胞中，低氧可通过环磷腺苷效应元件结合蛋白促进双调蛋白的基因表达。孕期时，低氧可促进胎盘中TACE mRNA和蛋白表达，且TACE和双调蛋白的水平线性相关。肺血管平滑肌细胞中，低氧也可诱导内皮素-1的释放，从而调节血管重塑和血管生成基因，包括双调蛋白基因［19］。
双调蛋白与Warburg效应
部分肿瘤细胞可通过增强无氧酵解、降低氧消耗量来维持生长，这一过程称作Warburg效应。最近对结直肠癌细胞系的研究表明，双调蛋白在激活Warburg效应的过程中发挥了关键作用。研究认为，在结直肠癌细胞系中，葡萄糖会促进GLUT1和双调蛋白的表达，提高HIF-1的活性，且抑制双调蛋白的表达将降低葡萄糖的消耗、减少乳酸生成。该过程受Max样蛋白调控［20］。
双调蛋白参与肿瘤的侵袭和转移
对乳腺、肺、肾、前列腺等多种组织器官的研究均表明，双调蛋白有促进细胞侵袭和运动的能力。在乳腺癌细胞中，双调蛋白可上调多种参与肿瘤细胞运动和侵袭的基因。转录因子HOXB9可诱导双调蛋白及其它ErbB配体的表达，导致细胞运动性上升，而EGFR抑制剂或敲减双调蛋白mRNA可抑制细胞的侵袭和移动［21］。双调蛋白mRNA仅在约2%～7%的正常人类结肠黏膜中存在，但60%～70%的原发和转移性结肠癌中均能检测到双调蛋白的表达。COX-2抑制剂塞来昔布可抑制结肠腺癌的播散，但并不能降低结肠癌的发病率。进一步研究发现，这与其促进双调蛋白分泌有关，且这一过程涉及Erk1-2和EGFR信号通路。小鼠中联合运用EGFR抑制剂或Erk1-2抑制剂，可降低结肠癌的发病率［22］。miR-34a是应用广泛的化疗药物，最新的研究发现其抑制肿瘤转移作用与其抑制双调蛋白的表达有关［23］。
E-钙黏蛋白对维持细胞间的黏附有重要作用。在上皮肿瘤中，E-钙黏蛋白常常失去功能。在双调蛋白转基因小鼠的角质细胞系和人卵巢癌细胞系中，双调蛋白可显著降低E-钙黏蛋白，提高肿瘤侵袭能力［24］。
肿瘤侵袭时涉及细胞外基质的降解，这一过程需要蛋白酶的参与。双调蛋白可诱导基质金属蛋白酶的表达，如基质金属蛋白酶-2和白明胶酶。双调蛋白还可诱导其他参与基质降解的因子表达，如尿激酶、细胞外基质金属蛋白酶诱导剂和纤溶酶原激活剂抑制剂。这一结论在头颈部肿瘤细胞系、乳腺癌细胞系和恶性间皮细胞瘤细胞系中证实［25］。
肿瘤细胞通过形态学变化、从非侵袭性向恶性转变的过程，叫做上皮-间质转变 (epithelial-mesenchymal transition，EMT)，这一过程是原位肿瘤细胞获得转移播散性所需要的。EMT期间，上皮细胞的不稳定将增加其运动性，提示EMT可增强细胞的侵袭和转移。在c-RAF诱导EMT转基因小鼠中，双调蛋白在肺腺癌中的表达显著高于在癌前病变中的水平。增加双调蛋白的表达，可通过EGFR信号通路介导EMT，并通过复杂机制抑制miR-448［26］。
Yes相关蛋白 (Yes-associated protein，YAP)在Hippo通路中起关键作用，且是小鼠和人类肿瘤中促进EMT和恶性转化的转录辅激活子，双调蛋白也是YAP的转录靶因子，并且参与YAP介导的细胞增殖和迁移。研究表明，双调蛋白可促进变形细胞在非锚定状态下的生存和生长能力，而肿瘤转移细胞的典型特征就是非锚定状态。在大鼠胰腺细胞系中，双调蛋白表达升高，且与淋巴结转移有关［27］。在结直肠癌患者中，双调蛋白被发现可以成为肝转移的预测指标［28］。此外，结直肠癌中，双调蛋白血清水平与血管侵袭有关，双调蛋白的高表达与肿瘤侵袭深度、远处转移和神经侵袭显著相关［29］。还有研究表明，非小细胞肺癌患者中，脑转移患者的血清双调蛋白水平明显升高［30］。值得注意的是，结直肠癌中局部双调蛋白的水平与肝转移密切相关，考虑到肝中的双调蛋白浓度很低，这一发现提示转移部位无需高浓度双调蛋白［31］。
肿瘤相关树突状细胞 (tumor-associated dendritic cell，TADC)存在于肿瘤微环境中。研究表明，TADC可在ATP介导下分泌大量双调蛋白，且双调蛋白通过激活STAT3和AKT，进一步激活下游信号通路，并促进肺癌细胞的增殖、转移和EMT［32］。
侵袭性肿瘤常有整合素表达的调节。整合素α6β1同E-钙黏蛋白一样，也属于细胞黏附分子家族。双调蛋白自分泌表达和整合素的激活，与结肠腺癌细胞的黏附、生长和分化有关。最新的研究表明，在人类软骨肉瘤细胞系中，双调蛋白可通过 Ras/Raf/MEK/ ERK/AP-1信号通路，促进整合素α6β1的表达及细胞的移动性。动物模型中，敲减双调蛋白可抑制软骨肉瘤的肺转移［33］。
综上，大量体外研究表明，双调蛋白参与了肿瘤细胞获得转移能力的过程，但双调蛋白在其中的具体作用，有待进一步探究。
双调蛋白与肿瘤治疗抵抗
双调蛋白参与肿瘤对放疗的抵抗。在放疗抵抗的胰腺癌细胞中，双调蛋白表达明显升高。有研究表明，K-RAS突变的肿瘤细胞可启动双调蛋白的自分泌，从而激活EGFR和下游PI3K-AKT生存通路，导致对放疗的抵抗［34］。
双调蛋白参与了肿瘤对多种化疗药物的抵抗。在乳腺癌细胞系和HepG2肝细胞肝癌细胞系中，双调蛋白与肿瘤细胞对顺铂的抵抗有关，但在肝癌细胞系中未发现类似的情况［11］。顺铂抵抗的MCF-7乳腺癌细胞选择性地上调双调蛋白的mRNA，用小干扰RNA敲减双调蛋白后，将反转这一抵抗［11］。双调蛋白还与肿瘤细胞对西妥昔单抗或帕尼单抗的抵抗有关，对结直肠癌细胞系的研究表明，旁分泌的双调蛋白可以保护周围细胞抵抗EGFR阻断治疗［35］。此外，结肠癌细胞可分泌双调蛋白，并通过增强EGFR/MAPK信号通路、降低PTEN等多种途径，抵抗化疗药物对PI3K的抑制［36］。
双调蛋白与肿瘤发生和进展的密切关系，为临床应用提供了广阔视角。目前，双调蛋白作为预后指标、疗效预测指标、耐药性评估指标的研究成果有望转化为临床应用。另外，以双调蛋白为靶点的药物也表现出一定的肿瘤抗性，提示双调蛋白作为药物靶点有广阔的应用前景。
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【中图分类号】R730.23
【文献标志码】A
【文章编号】1674-9081(2017)01-0056-05
DOI：10.3969/j.issn.1674-9081.2017.01.013
(收稿日期：2015-07-19)
基金项目：协和青年科研基金项目 (3332015025);北京协和医学院“大学生创新创业训练计划”(2015zlgc0601)
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