·再生医学·
龚佳欢1**，韦自卫2，石嘉琪2，牛长梅2，赵亚红1，杨宇民1
（1南通大学神经再生重点实验室；2南通大学医学院，江苏226001）
[摘 要] 目的：通过不同方法研制出取向性静电纺丝复合材料，确定材料与神经再生之间的构效关系，为理想的神经再生植入装置的设计提供扎实的理论基础，为周围神经缺损的修复提供更有效的方法。方法：本实验通过切片法结合静电纺丝及3D打印等技术制备具有取向性的丝素（silk fibroin，SF）/石墨烯（Graphene，Gr）复合材料。显微镜观察材料表面结构形貌。电化学分析提供复合材料的电活性表征。细胞共培养观察该复合材料对神经细胞的影响。结果：不同方法制备的不同取向性复合材料具有不同的导电性，其中3D打印生成取向性的静电纺丝复合材料具有良好的导电性，并且通过体外细胞实验表明其支持培养的施万细胞的存活和生长，揭示其具有良好的生物相容性。结论：结果均表明3D打印取向性复合材料结合了优秀的导电性能与良好的生物相容性等性质，很好地模拟了神经发育的天然神经细胞微环境。
[关键词] 取向性；丝素；石墨烯；神经再生
周围神经缺损尤其是长距离或粗大神经缺损修复是临床治疗的世界性难题[1-2]。近年来，组织工程神经，作为自体或异体神经移植的替代物，用于桥接周围神经缺损发展迅速，一些产品已进入临床或即将进入临床使用，为周围损伤的修复带来了新的希望[3-4]。但是，上述产品临床应用仅见于修复长度小于30 mm外周神经的报道，且修复效果亟待提升。因此，急需开发修复更长距离及效果更好的人工神经移植物产品。组织工程的发展依赖于生物材料新技术的应用，理想的生物材料必须既能支持组织生长，又可特异性激发理想的细胞反应，同时能刺激特异性细胞功能。如果能将这两种特性有效的结合起来，则可为组织工程提供一种理想的备选材料。目前导电高分子材料已悄然走进生物医学领域，是生物材料和组织工程学家关注的焦点。导电高分子的表面特性,电荷浓度和可浸润性，可在电势存在下发生可逆变化。这些特性赋予导电高分子材料在生物应用领域独特的优势[5-7]。最近研究表明，生物材料不仅为组织和器官再生提供机械和三维结构的支撑，而且其自身的一些性能和因素还可以调控组织和器官的再生，尤其是材料的表面性能[8-9]。生物材料的表面性能可以调控细胞的生长、分化，所以制备具有精细三维结构的生物支架是目前治疗神经缺损最有希望的方法之一[10-11]。研究表明，当选取合适的图形尺寸的时候，可以明显促进神经再生的过程，这对于揭示蛋白图形尺寸对神经再生的影响具有重要参考价值[12-13]。我们的研究以导电材料、材料表面图形结构对周围神经损伤作用的研究为基础，同时将这些因素特效结合起来，作为周围神经组织工程应用的研究。
1.1 材料 （1）试剂：DMEM培养基、胎牛血清（FBS）、青链霉素（PS）、胰酶等试剂均购自Gibco；多聚赖氨酸（PLL）购自Sigma；天然蚕丝购自于江苏海安新源蚕业；壳聚糖购自于南通兴城生物制品厂；明胶（医用级）购自于青海明胶有限公司；醋酸购自于默克公司；石墨烯购自TCI（G0441）。（2）仪器：静电纺丝接收装置为自制；3D打印机（Regenovo 3D BioArchitect BP-016031501，杭州捷诺飞生物科技有限公司）；冰冻切片机（Leica公司）；倒置显微镜（Leica公司）；二氧化碳细胞培养箱（Napco公司）。
1.2 方法
1.2.1 再生丝素膜的制备：将新鲜蚕丝按1∶50（m/v）放于0.5%的Na2CO3溶液中煮沸以脱去外层的丝胶，每次煮沸30 min，重复3次，三蒸水充分洗涤，然后置于超净台内自然晾干，得到脱胶蚕丝。将脱胶后的蚕丝溶解在三元溶剂体系中（无水CaCl2∶无水C2H5OH∶三蒸水=1∶2∶8）得到黄色透明溶液，溶解温度70℃～73℃。溶液置于纤维素管（截留分子量：12～14kD）内，用Millipore三蒸水透析3天，每6 h换液，直至溶液透明。透析好的丝素溶液倒入漏斗中抽滤除去未溶解的杂质，随后倒于培养皿，放在超净台中鼓风晾干。待晾干后揭下即形成再生丝素膜。
1.2.2 静电纺取向性混合材料的制备
1.2.2.1 石墨烯膜制备：将再生丝素蛋白溶液浓缩至20%，按比例加入相应量石墨烯，超声混匀，超声后的溶液置于培养皿中，在超净工作台中风干成膜，乙醇处理成型，水洗至中性，置于离心管中保存待用。
1.2.2.2 切片取向材料的制备：将石墨烯薄膜剪成1 cm×2 cm，做成冻台，进行冰冻切片。切片厚度为10～20 μm，贴片于24孔板的圆形玻片上，即为单层的取向性石墨烯复合膜。将丝素膜置于两层石墨烯膜之间，各膜之间的空隙用生物胶水进行粘贴即得两层的取向性石墨烯复合膜。多层的制作同理。
1.2.2.3 静电纺丝素溶液的制备：称取一定质量的丝素膜，溶解在99%的甲酸中形成溶液，浓度15%～20%（m/v），中等转速旋转至溶解完全。
1.2.2.4 静电纺过程：取出上述石墨烯取向性材料作为基质，表面用静电纺纯丝素处理，最终形成在衬底纳米纤维表面下具有取向性的结构。采用自制的静电纺丝设备对丝素溶液进行静电纺丝。具体过程如下：将纺丝液装在带不锈钢针头（9#）的注射器中，通过微量注射泵向前推进，针头与高压电源正极相连，铝箔作为接收装置与负极相连，接收装置与注射器的针头保持一定的距离。在电场作用下，针头处的液滴克服表面张力形成射流，喷射过程中，溶剂挥发，丝素蛋白被快速拉伸成微纳米纤维沉积在锡箔纸上。
1.2.3 3D打印制备取向性材料
1.2.3.1 3D打印材料的制备：取再生丝素蛋白浓缩至30%，按照比例加入明胶和胶原以增强其黏度和韧性，再加入石墨烯粉末，置于离心管中超声波仪超声处理30 min。超声后的溶液注入料筒中。
1.2.3.2 打印过程：CAD制图中对相关参数进行设计，通过该软件重建三维图像，导出保存为3D打印机能识别的文件格式，进行打印。设置相应的参数进行打印（表1），获得不同尺寸不同间隙取向性排列的结构：喷嘴温度40℃，打印室温度控制在4℃以保持支架形状，鲁尔锁锥形针头喷嘴直径为0.21 mm，适当调整压力0.4～0.45 MPa、打印速度5～10 mm/s和间距0.4～0.7 mm。
表1 3D打印不同参数的制备石墨烯取向性材料
1.2.4 导电性测定：使用电化学工作站在室温测不同方法制备得到的取向性复合材料的导电性。探针间距10 mm，每个样品测3次，每组测3个样品。
1.2.5 取向性材料与施万细胞共培养：从1～3d的SD大鼠背根神经节和坐骨中提取分离培养施万细胞（SCs）。背根神经节和坐骨神经用0.125%胰酶在37℃孵育30 min后用含有10%胎牛血清（FBS）基本培养基（DMEM）培养。第二天加入10 mmol/L的阿糖胞苷孵育48 h抑制成纤维细胞生长。每3天用含10%FBS，2 mmol/L forskolin和2 ng/mL heregulin来促进细胞增殖。等到细胞生长到皿的80%～90%，可以进行纯化。同样用胰蛋白酶将细胞消化下来，用anti-Thy1.1抗体（1∶1 000）冰浴2 h，之后用补体孵育1 h。在这之后细胞可以用含生长因子的完全培养基培养，隔天换液直到细胞长满培养皿。
不同的取向性材料制备完成后，紫外照射，75%的乙醇处理材料30 min，用灭菌的Millipore纯水洗涤2次，随后将样品转移到24孔板中。施万细胞制备成细胞悬液，按照5×104cells/mL的密度接种细胞。培养到相应时间，PBS洗涤，4%多聚甲醛固定便于形态学检测。
1.3 统计学处理 实验数据以
2.1 材料形貌观察 无论是切片静电纺制备还是3D打印技术均能制备出取向性复合材料（图1）。如图1A～C（见封二）为切片结合静电纺生成取向性复合材料，制备不同宽度、不同间隙的的丝素石墨烯复合取向性材料。将石墨烯与浓缩的丝素蛋白混合溶液和支撑材料注入反应器中，设置相应的参数进行打印，获得不同尺寸不同间隙线性排列的结构，且在玻片上贴附牢固，如图1D～F（见封二）。
2.2 导电性评价 本实验中结合丝素蛋白和石墨烯生物材料的优良特性，根据图1中制备的6种取向性生物复合材料及纯丝素材料进行电化学性能的测定，不同的导电率如图2。结果发现纯丝素蛋白导电性最低，而将石墨烯进行制备、掺杂，将其与丝素蛋白进行掺杂反应，复合物的电导性相比于纯丝素有所进一步增加，复合物的电导率呈上升趋势。发现切片结合静电纺的取向性导电型静电纺复合材料及3D打印生成取向性的导电型静电纺复合材料的导电性均随着石墨烯宽度的提高而提高，其中宽度最高的组别导电性最大。
图2 不同取向性复合材料的电导率
2.3 取向性材料对施万细胞活力的影响 实验发现，在切片结合静电纺的取向性材料上，细胞在第3天时就表现出成团，细胞活力下降，细胞胞体逐渐减小，折光率显著降低并开始出现细胞凋亡现象，到第7天时大部分细胞均凋亡（故未提供图片）。同时，层数越多的材料，结构越难保持，在培养细胞的过程中，起层较为严重（图3C，见封二）。用3D打印技术生成取向性的导电型静电纺复合材料（图3 D，E，F，见封二），在材料上种入施万细胞后，第3 d，7 d拍照观察其生长状况，发现相比于切片结合静电纺丝复合材料对于施万细胞有更好的相容性，材料上细胞胞体形状正常、表面透亮光洁且折光性良好，同时不同的间隙与石墨烯不同的宽度对细胞也有影响。同样条件下，速度为9～10 mm/s，间距为0.6 mm的材料上SCs长势较好，在第7天时细胞仍在增殖过程中，说明该取向性材料具有良好的生物相容性。
材料表面的精细空间结构对细胞和组织的影响正成为研究的热点。同时也有研究表明当选取合适的图形尺寸的时候，发挥接触引导作用[14]，引导细胞的运动、迁移呈现沿着图形的方向排列生长，明显促进神经再生的过程，这对于揭示图形尺寸对神经再生的影响具有重要参考价值。因此本课题中我们采用图形化的方法制备具有取向性的复合导电材料，对神经细胞的生长进一步加以定向诱导，希望实现更快的神经再生和损伤修复。本研究结果可以看到，切片结合静电纺技术可以制备出具纳米纤维结构的复合材料，但是制备的取向性材料中，较多层的石墨烯容易起层，在玻片上贴附不牢固。为了获得线性排列的导电静电纺纤维，利用3D打印技术制备，其特点是对需打印的物体形状无特殊要求，且打印的精度非常高。
近年来，新型导电性生物材料在神经组织工程研究中受到研究人员的高度关注，这类导电性生物材料主要包括导电性纳米材料，如碳纳米管、石墨烯等，与导电性高分子聚合材料，如聚吡咯、聚苯胺、聚噻吩类等。而丝素蛋白是一种源于蚕丝的天然高分子纤维蛋白质，有良好的生物相容性，力学性能，生物可降解性和最小的免疫原生物[15-16]。本实验结果发现纯丝素蛋白导电性最低，而将石墨烯进行制备、掺杂，将其与丝素蛋白进行掺杂反应，复合物的电导性相比于纯丝素有所进一步增加，复合物的电导率呈上升趋势，同时发现切片结合静电纺的取向性导电型静电纺复合材料及3D打印生成取向性的导电型静电纺复合材料的导电性均随着石墨烯宽度的提高而提高。
神经系统通过神经元的生物电信号传递支配包括感觉及运动在内的各项日常活动，神经细胞在体内进行信息传递时主要依靠突触产生的动作电位，通常细胞膜具有负的膜电位，外界电刺激会影响细胞的膜电位，从而引起细胞内部化学信息的变化以及信号传导通路的变化。因此，从神经细胞的导电性出发，如果在材料表面赋予一定的导电性，则会不同程度地影响神经细胞的黏附和生长，为神经系统损伤和疾病的治疗带来了新的治疗手段。理想的生物材料必须是能支持组织生长，而施万细胞在神经再生过程中发挥重要作用，所以我们选取石墨烯结合丝素制备取向性的复合材料，与施万细胞进行共培养。实验结果证明该取向性材料具有良好的生物相容性。
开发新型的取向性导电复合纳米材料对我国未来的医疗事业及组织工程学的发展有着重要的意义。本课题以石墨烯与丝素蛋白有效结合通过各种方法制备静电纺取向性复合材料，克服单纯用一种材料很难完全满足所有神经支架的需求，以提高其物理的生物的应用性能，另外由于它们可调节的化学及物理性能有望成为优化神经支架的构建，表现出更好的促神经再生功能。上述活性研究结果表明，3D打印取向性复合材料结合了优秀的导电性能与良好的生物相容性等性质，很好地模拟了神经发育的天然神经细胞微环境，将为今后进一步设计并制备出用于修复周围神经缺损的神经移植物提供扎实的理论基础。
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Preparation of oriented bioconductive materials and their effects on nerve regeneration
GONG Jiahuan1,WEI Ziwei2,SHI Jiaqi2,NIU Changmei2,ZHAO Yahong1,YANG Yumin1
(1Jiangsu Key Laboratory of Neuroregeneration;2School of Medical,Nantong University,Jiangsu 226001)
[Abstract] Objective:The composites with different properties were fabricaed by different methods.The relationship between material structures and nerve regeneration were studied,and the design of this ideal nerve regeneration implant device was expected to provide a solid theoretical basis and a more effective method for the repair of peripheral nerve defects.Method:In this experiment,different silk fibroin (SF)and grapheme(Gr)composites with orientation were prepared by slicing combined with electrospinning,3D printing.The material surface morphology structures were observed with the microscopes and the electrochemical analysis provided the electrical activity of the composites.The effect of the composites on Schwann cells was observed by the optical microscope.Results:The results showed that different oriented composites have different conductivity.Additionally,the composites had good biocompatibility,and supported the survival and growth of cultured Schwann cells by cell experiments in vitro.Conclusion:In general,all the results indicated that the composites formed by 3D printing had good biocompatibility and excellent electrical conductivity,and simulated the neural microenvironment for nerve regeneration.
[Key words] oriented;silk fibroin;grapheme;nerve regeneration
[中图分类号] Q819
[文献标志码]A
[收稿日期] 2017-01-22
［文章编号］1006-2440（2017）01-0001-05
*[基金项目] 国家自然科学基金资助项目（81671823，81371687）；南通大学研究生科研创新计划资助项目（YKC15065）。
**[作者简介]龚佳欢，女，汉族，江苏南通人，生于1991年11月，硕士在读。研究方向：组织工程和生物材料。 通信作者：杨宇民，E-mail：yangym@ntu.edu.cn
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