李慧明， 贾健安， 王蒙蒙， 顾 星， 房 萌， 高春芳
（第二军医大学附属东方肝胆外科医院实验诊断科，上海 200438）
摘要：目的 分析一种新型的乙型肝炎病毒（HBV）感染标志物——乙型肝炎核心相关抗原（HBcrAg）与原发性肝细胞癌（HCC）患者癌组织和癌旁组织内共价闭合环状DNA（cccDNA）、HBV DNA水平的关系。方法 收集行肝癌切除术的HBV感染相关的HCC患者95例，用化学发光法检测患者血清HBcrAg水平，同时用聚合酶链反应（PCR）荧光探针法分别对配对的癌组织和癌旁组织内cccDNA、HBV DNA进行定量检测。结果 乙型肝炎e抗原（HBeAg）+/乙型肝炎e抗体（HBeAb）-组、HBeAg+/HBeAb+组、HBeAg-/HBeAb+组HBcrAg水平分别为（6.41±1.18）、（5.80±0.50）和（5.16±0.94）lgU/mL，3个组间差异有统计学意义（P＜0.001）。HCC患者HBcrAg与癌旁组织cccDNA和癌旁组织HBV DNA具有相关性（r=0.359、0.440，P＜0.001），TNMⅠ期HCC患者HBcrAg与癌旁组织cccDNA和癌旁组织HBV DNA具有相关性（r=0.491、0.578，P＜0.01），TNMⅡ期HCC患者HBcrAg与癌旁组织cccDNA和癌旁组织HBV DNA具有相关性（r=0.339、0.402，P＜0.05），TNMⅢ期HCC患者HBcrAg与癌旁组织cccDNA和癌旁组织HBV DNA无相关性。结论 HBcrAg可以辅助区分发生HBeAg血清学转换和未发生转换的患者；在乙型肝炎表面抗原（HBsAg）+HCC患者中，HBcrAg与癌旁组织HBV DNA及癌旁组织cccDNA具有一定的相关性，但其相关性未表现出比现有血清标志物（HBeAg及HBV DNA）更好。
关键词：乙型肝炎核心相关抗原；乙型肝炎e抗原；DNA；乙型肝炎病毒；原发性肝细胞癌
原发性肝细胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是全球发病率排第5位、死亡率排第3位的恶性肿瘤[1]。乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）感染是HCC的重要病因之一[2]。核苷酸类似物虽然可抑制HBV DNA的复制，却不能抑制病毒共价闭合环状DNA（covalent closed circular DNA，cccDNA）的活性，因此与乙型肝炎核心抗原（hepatitis B core antigen，HBcAg）和乙型肝炎e抗原（hepatitis B e antigen，HBeAg）相关的蛋白还将持续产生[3]。乙型肝炎核心相关抗原（hepatitis B core-related antigen，HBcrAg）是一个反映HBV感染但不同于乙型肝炎表面抗原（hepatitis B surface antigen，HBsAg）和HBV DNA的血清标志物[4-5]。有文献报道，血清HBcrAg可以更好地监测抗病毒药物的治疗终点[6]。然而，目前对慢性乙型肝炎患者HBcrAg的研究较多[7-8]，对HCC患者HBcrAg的研究较少，因此本研究将主要分析HCC患者不同HBeAg状态时HBcrAg的水平差异，以及HBcrAg水平与肝癌癌组织和癌旁组织内总HBV DNA和cccDNA的关系。
一、研究对象
收集2011年4月至2013年4月在第二军医大学附属东方肝胆外科医院接受肝癌切除术的HCC患者病例，纳入标准：HBsAg（+），血清HBV DNA＞1 000 IU/mL，无抗病毒用药史；排除标准：丙型肝炎病毒（hepatitis C virus，HCV）、人类免疫缺陷病毒（human immunodeficiency virus，HIV）共感染，肝移植及恶性血液病和其他实体瘤肿瘤。共95例HCC患者纳入队列，其中男79例、女16例，年龄[中位数（四分位数）]为53（30，71）岁，甲胎蛋白（alphafetoprotein，AFP）、丙氨酸氨基转移酶（alanine aminotransferase，ALT）、总胆红素（total bilirubin，TBil）、直接胆红素（direct bilirubin，DBil）[中位数（四分位数）]分别为166.1（1，871 000）ng/mL、43（4.5，2 123）U/L、 15.3（4.3，40.1）μmol/L、5.8（1.6，26.0）μmol/L。其肝癌癌组织、癌旁组织及血清样本均保存于-80 ℃冰箱。所有患者均已签署知情同意书。
二、方法
血清样本HBcrAg使用化学发光酶免疫分析（chemiluminescence enzyme immunoassay，CLEIA）法检测，仪器为LUMIPULSE G1200全自动免疫分析仪（日本丽珠试剂有限公司），按照试剂说明书进行上机前处理：150 μL血清与150 μL前处理液混匀，60 ℃加热30 min。患者肝功能生化指标采用HITACHI 7600全自动生化分析仪（日本日立公司）检测。病毒标志物包括HBsAg、乙型肝炎表面抗体（hepatitis B surface antibody，HBsAb）、HBeAg、乙型肝炎e抗体（hepatitis B e antibody，HBeAb）、乙型肝炎核心抗体（hepatitis B core antibody，HBcAb），采用Abbott i2000全自动免疫发光分析仪（美国雅培公司）在术前进行检测。使用QIAamp DNA Mini kit（德国QIAGEN公司）从血清、癌组织和癌旁组织中提取HBV DNA。组织HBV DNA和cccDNA扩增均使用实时荧光定量聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR），仪器为ABI 7500型实时荧光定量PCR仪（美国ABI公司），HBV DNA和cccDNA定量所用荧光探针分别为P1、P2，P1为FAM-ATCTGCCGGACCGTGTGC-TAMARA，P2为FAM-CTCACCAACCTCCTGTCCTCCATAMARA。
三、统计学方法
使用SPSS 18.0软件进行统计分析，计量资料用
一、血清HBcrAg水平在不同的HBeAg/HBeAb组间的分布差异
在HBV感染的过程中，由于宿主的免疫应答，HBeAg会发生血清学转换，而在不同时期，HBeAg血清学转换会表现出不同的特征。本研究HBeAg+/HBeAb-组、HBeAg+/HBeAb+组、HBeAg-/HBeAb+组血清HBcrAg水平分别为（6.41±1.18）、（5.80±0.50）、（5.16±0.94）lgU/mL，差异具有统计学意义（P＜0.001），HBeAg-/ HBeAb+组（已经发生了血清学转换）患者血清HBcrAg水平最低，与其他2个组间差异均有统计学意义（P＜0.05），而HBeAg+/HBeAb-组与HBeAg+/HBeAb+组之间血清HBcrAg水平差异无统计学意义（P=0.057）。
二、HBcrAg与HBV DNA、cccDNA的相关性
HBcrAg与HCC患者血清HBV DNA相关性最高（r=0.486，P＜0.001），其次为癌旁组织HBV DNA（r=0.440，P＜0.001）及癌旁组织cccDNA（r=0.359，P＜0.001）。HBcrAg、HBeAg与癌组织HBV DNA、cccDNA无明显相关性。分组分析发现，HCC患者HBcrAg只与HBeAg-/HBeAb+组患者癌旁组织cccDNA（r=0.341，P=0.008）、癌旁组织HBV DNA（r=0.377，P=0.003）、血清HBV DNA（r=0.541，P＜0.001）存在线性相关关系，而在HBeAg+/HBeAb-组、HBeAg+/HBeAb+组并未得到类似的结果。见表1。
表1 HBcrAg与HBV感染不同时期的其他标志物的相关性分析
组别HBcrAg与各指标的r值（P值）血清HBV DNA癌组织cccDNA癌组织HBV DNA癌旁组织cccDNA癌旁组织HBV DNA HBeAg+/HBeAb-组0.151（0.538）-0.068（0.783）-0.161（0.511）0.225（0.355）0.327（0.131）HBeAg+/HBeAb+组0.228（0.379）0.456（0.066）0.211（0.046）0.168（0.518）0.215（0.407）HBeAg-/HBeAb+组0.541（＜0.001）0.145（0.305）0.032（0.812）0.341（0.008）0.377（0.003）合计0.486（＜0.001）0.129（0.230）0.047（0.651）0.359（＜0.001）0.440（＜0.001）
三、不同TNM分期时HBcrAg、血清HBV DNA、HBeAg与癌旁组织HBV DNA、癌旁组织cccDNA的相关性
对于TNMⅠ期的HCC患者，HBcrAg、血清HBV DNA、HBeAg均与癌旁组织cccDNA 和癌旁组织HBV DNA有着较好的相关性。但HBcrAg对处于TNM Ⅲ期的HCC患者没有表现出与肝组织内HBV DNA有相关性，并且Ⅰ期至Ⅱ期相关系数减小。相反，血清HBV DNA和HBeAg与肝组织内HBV DNA的相关性较好。见表2。
表2 不同TNM分期HCC患者血清标志物与癌旁组织HBV DNA、cccDNA相关性的比较
注：*P＜0.05、**P＜0.01
TNM分期癌旁组织cccDNA与各指标的r值癌旁组织HBV DNA与各指标的r值HBcrAg 血清HBV DNAHBeAg HBcrAg 血清HBV DNAHBeAgⅠ期0.491**0.590**0.515**0.578**0.714**0.459**Ⅱ期0.339*0.3600.705**0.402*0.421*0.554**Ⅲ期0.1920.703**0.415*0.3020.807**0.403*
四、HBcrAg、HBeAg、血清HBV DNA 对癌旁组织HBV DNA、癌旁组织cccDNA预测价值的比较
因HBcrAg与癌旁组织HBV DNA及癌旁组织cccDNA均存在线性相关关系，故对主要临床定量指标与癌旁组织HBV DNA及癌旁组织cccDNA的相关性进行了分析，并进一步使用多元线性回归分析预测癌旁组织HBV DNA及癌旁组织cccDNA。结果表明，年龄、血清HBV DNA和HBeAg与癌旁组织cccDNA具有相关性（r2=0.414），血清HBV DNA、HBeAg和白蛋白与癌旁组织HBV DNA具有相关性（r2=0.484）。尽管在一元回归分析中，HBcrAg与癌旁组织HBV DNA及癌旁组织cccDNA具有一定的相关性，然而经多元回归分析后发现，HBcrAg相比HBeAg等指标，未能表现出更好地预测癌旁组织HBV DNA及癌旁组织cccDNA的效能。见表3。
表3 癌旁组织HBV DNA和癌旁组织cccDNA的多元回归分析
指标癌旁组织cccDNA癌旁组织HBV DNA标准化系数r2值P值标准化系数r2值P值年龄0.2610.574血清HBV DNA0.419＜0.0010.566＜0.001 HBeAg0.281 0.0020.217 0.008白蛋白-0.0890.296-0.168 0.031 HBcrAg-0.0190.8550.0410.673 0.0020.046 0.414 0.484
本研究表明，HBcrAg与癌组织HBV DNA和癌组织cccDNA 无明显相关性，但与癌旁组织中这2种DNA存在明显的线性相关关系。血清HBcrAg与血清HBV DNA（r=0.486）、癌旁组织HBV DNA（r=0.440）及癌旁组织cccDNA（r=0.359）的相关性一般，低于SUZUKI等[9]（血清HBV DNA r=0.69，cccDNA r=0.74）、WONG等[10]（血清HBV DNA r=0.82，cccDNA r=0.66）以及MAASOUMY等[11]（血清HBV DNA r=0.87）以慢性乙型肝炎患者为研究对象的结果，而与HOSAKA等[3]以HCC患者癌旁组织为研究对象的研究结果较接近（血清HBV DNA r=0.67，cccDNA r=0.48），故推测研究对象的临床背景差异可能是本研究中HBcrAg与血清HBV DNA及癌旁组织cccDNA相关性相对较低的原因，而HBcrAg与癌组织中2种DNA无相关性的原因可能是肝癌组织微环境改变，引起HBV的复制状态与癌旁组织和肝炎组织的HBV不同[12]。
此外，本研究还对不同的HBeAg血清学转换时期的患者进行了分析，发现HBcrAg的水平与HBeAg-/HBeAb+组有关，而与HBeAg+/HBeAb-组和HBeAg+/HBeAb+组无关。提示HBcrAg对是否发生HBeAg血清学转换具有较好的评估价值。SETO等[13]检测了HBV自然感染史患者不同时期的HBcrAg水平，借此区分HBeAg阴性患者的活动期和非活动期。MAASOUMY等[11]的研究中分别分析了不同HBV自然感染史分期患者HBcrAg与血清HBV DNA的相关性，在HBeAg阳性免疫清除期和HBeAg阴性肝炎时期相关性较高（r=0.651、0.740），在HBeAg阳性免疫耐受期相关性较低（r=0.453），而在HBeAg阴性病毒携带时期，无明显相关性（r=0.178），同时也发现HBcrAg水平可以很好地区分HBeAg阴性肝炎活动期和非活动期。由此可见HBcrAg 与血清HBV DNA的相关性与HBV感染阶段有关。本研究中HBcrAg与血清HBV DNA及癌旁组织cccDNA的相关性较低，可能是此原因所致。这种相关性的差异可能与乙型肝炎相关肝癌时期病毒生活周期的改变有关，在慢性乙型肝炎患者中，HBV DNA复制、包装、分泌整个过程有条不紊地进行，HBV DNA复制水平及前C/C基因表达水平非常协调，而在HBeAg阴性病毒携带时期或肝癌时，这一协调性很可能被打破[14-16]，于是表现出HBcrAg与血清HBV DNA相关性较差的现象，同时肝癌患者乙型肝炎核心蛋白变异增多这一观点已被广为接受[1-18]，那么前C/C基因变异是否是打破这一协调性的重要因素之一呢？这值得进一步探讨。
基于癌组织中HBcrAg与癌旁组织HBV DNA及癌旁组织cccDNA的相关性较差这一发现，本研究对不同分期HCC患者HBcrAg与肝内HBV DNA水平的相关性作了进一步分析。结果显示，随着肿瘤进展，HBcrAg与癌旁组织HBV DNA及癌旁组织cccDNA的相关性明显变小，同比TNMⅠ期HCC患者（r=0.578、0.491），Ⅱ期HCC患者HBcrAg与血清HBV DNA相关系数也变小（r=0.402、0.339），Ⅲ期HCC患者更是无相关性，这一现象提示可能随着肿瘤进展，HBV DNA特别是在肝细胞内的复制水平与核心蛋白表达水平无统一性，更无规律可寻。
本研究多元回归分析发现，相比其他血液指标及一般资料，HBcrAg未能表现出更好地预测癌旁组织HBV DNA及癌旁组织cccDNA的效能，与血清HBV DNA水平及血清HBeAg定量水平相比无明显优势。这可能与HBcrAg的组成有关，HBcrAg包含HBeAg、HBcAg及p22cr，从相关性分析也可看出肝癌组织内HBV核酸载量与HBeAg具有较好的相关性。因此，在用血清指标预测癌旁组织HBV DNA及癌旁组织cccDNA时，HBeAg被纳入回归方程。
综上所述，HBcrAg作为一种新型的HBV感染血清标志物，对于辅助区分发生HBeAg血清学转换和未转换的患者具有一定价值，在HBsAg+HCC患者中与血清HBV DNA、癌旁组织HBV DNA及癌旁组织cccDNA具有一定的相关性，但未表现出比现有血清指标（HBeAg及HBV DNA）更好的相关性。HCC患者不同于单纯的HBV感染者，HBcrAg用于预测肝癌组织中HBV DNA、cccDNA的价值有限。
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（本文编辑：姜 敏）
Correlation between serum HBcrAg and intracellular HBV DNA in patients with hepatocellular carcinoma
LI Huiming，JIA Jian'an，WANG Mengmeng，GU Xing，FANG Meng，GAO Chunfang.
（Department of Clinical Laboratory，Eastern Hepatobiliary Surgery Hospital，the Second Military Medical University，Shanghai 200438，China）
Abstract：Objective To assess the correlations of a newly-developed hepatitis B virus（HBV） infection marker，hepatitis B core-related antigen（HBcrAg），with covalent closed circular DNA（cccDNA） and HBV DNA in tumor tissue and adjacent non-tumor tissue among hepatocellular carcinoma（HCC） patients. Methods A total of 95 HBV infection-related patients who +/hepatitis B e antibody（HBeAb）-group，HBeAg+/HBeAb+group and HBeAg-/HBeAb+group were（6.41±1.18），（5.80±0.50） and（5.16±0.94）lgU/mL，respectively，and there was statistical significance among these 3 groups（P＜0.001）. There were correlations of HBcrAg with adjacent non-tumor tissue cccDNA and adjacent non-tumor tissue HBV DNA in HCC patients（r=0.359 and 0.440，P＜0.001）. In HCC patients of TNM stage Ⅰ，HBcrAg was associated with adjacent non-tumor tissue cccDNA and adjacent non-tumor tissue HBV DNA（r=0.491 and 0.578，P＜0.01）. In HCC patients with TNM stage Ⅱ，HBcrAg was correlated with adjacent non-tumor tissue cccDNA and adjacent non-tumor tissue HBV DNA（r=0.339 and 0.402，P＜0.05）. However， in HCC patients with TNM stage Ⅲ，no correlation of HBcrAg and adjacent non-tumor tissue cccDNA and adjacent non-tumor tissue HBV DNA. Conclusions HBcrAg can help with distinguishing HBeAg positive and negative HCC patients. Although HBcrAg has correlations with adjacent non-tumor tissue HBV DNA and cccDNA in hepatitis B surface antigen（HBsAg）+HCC patients，it does not show better correlations than other serum markers such as HBeAg and HBV DNA.
received：hepatic resection for HCC were enrolled. Serum HBcrAg were determined by chemiluminescence immunoassay. HBV DNA and cccDNA in tumor tissue and adjacent non-tumor tissue were quantified by polymerase chain reaction（PCR） fluorescent probe. Results The levels of HBcrAg in hepatitis B e antigen（HBeAg）
Key words：Hepatitis B core-related antigen；Hepatitis B e antigen；DNA；Hepatitis B virus；Hepatocellular carcinoma
文章编号：1673-8640（2016）011-0948-05
中图分类号：R446.62
文献标志码：A
DOI：10.3969/j.issn.1673-8640.2016.011.005
作者简介：李慧明，男，1991年生，硕士，技师，主要从事乙型肝炎病毒基因变异在乙型肝炎病毒相关肝细胞癌中的临床意义研究。
通讯作者：高春芳，联系电话：021-81875131。
收稿日期：（2015-12-11）
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