孙睿峰1， 项智灏1， 陈福增1， 茹欢委1， 麦俊涛1， 袁 俐2， 刘 军1
（ 1.复旦大学生命科学学院遗传工程国家重点实验室，上海 200438；2.新疆石河子大学，新疆 石河子 832002）
摘要：目的 评价2种结核分枝杆菌（MTB）潜伏生长状态下高表达的蛋白——Rv3160c抗原、35kD抗原对MTB潜伏感染人群的血清学鉴别诊断潜力。 方法 纯化获得Rv3160c抗原、35kD抗原，采用C57BL/6小鼠模型评价其免疫原性。以商品化的检测抗原——早期分泌抗原靶蛋白6（ESAT-6）和38kD为阳性参照，测定Rv3160c抗原、35kD抗原在20例活动性肺结核患者（活动性肺结核组）、25例MTB潜伏感染者（MTB潜伏感染组，即与活动性肺结核患者长期密切接触者）、24名健康体检者（正常对照组）血清特异性抗体反应，即检测抗Rv3160c抗体、抗35kD抗体水平。 结果 Rv3160c抗原、35kD抗原均能够在实验小鼠体内引起较高水平的体液免疫反应，血清抗体滴度达到1∶25 600，接近阳性参照抗原Ag85A的水平。MTB潜伏感染组血清抗Rv3160c抗体和抗35kD抗体水平均明显高于正常对照组（P＜0.01），且抗35kD抗体水平明显高于活动性肺结核组（P＜0.05），但MTB潜伏感染组和活动性肺结核组之间血清抗Rv3160c抗体水平差异无统计学意义（P＞0.05）。MTB潜伏感染组和活动性肺结核组血清抗ESAT-6抗体水平均高于正常对照组（P＜0.01），而MTB潜伏感染组和活动性肺结核组之间差异无统计学意义（P＞0.05）。MTB潜伏感染组血清抗38kD抗体水平明显高于活动性肺结核组和正常对照组（P＜0.05），而活动性肺结核组与正常对照组之间差异无统计学意义（P＞0.05）。Rv3160c抗原、35kD抗原在MTB潜伏感染者的血清中产生较强的抗原-抗体反应，与正常对照者的血清反应较弱；35kD抗原与活动性肺结核患者的血清反应也较弱，其血清反应模式与38kD抗原类似；Rv3160c抗原无法区分活动性肺结核患者和潜伏感染人群，其血清反应模式与ESAT-6接近。结论 Rv3160c抗原和35kD抗原对于潜伏性结核感染具有高度特异性，将有望用于MTB潜伏感染的鉴别诊断。
关键词：结核分枝杆菌；Rv3160c抗原；35kD抗原；潜伏感染；血清诊断
结核病是目前全球最致命的传染病，2014年共有150万人死于结核病［1］。感染结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis，MTB）之后，约有90%的被感染者不会立即发病，而是出现一种亚临床状态，即无放射检查征象、MTB纯蛋白衍生物（purified protein derivative，PPD）皮试阳性的潜伏感染状态（latent tuberculosis infection，LTBI）。由于潜伏感染人群大、范围广、病因复杂、病程长、不易诊断，因此已经成为导致结核病暴发的一个重要因素［2］。准确诊断MTB潜伏期感染者是控制结核病传播的关键环节，对于结核病的防治具有十分重要的意义。其中，筛选、优化哪些抗原或多肽用于诊断是研究者首先需要面对的难题，更是突破这一瓶颈问题的关键［3］。
目前，采用选自MTB基因组差异区（region of difference，RD）1基因编码的特异性蛋白，如早期分泌抗原靶蛋白6（early secretory antigenic target-6，ESAT-6）［4］和培养滤液蛋白10（culture filtrate protein-10，CFP-10）建立的γ-干扰素释放试验（interferon-gamma release assay，IGRA）是诊断包括LTBI在内的MTB感染的特异性方法［5］。但是，在不同的高危人群中进行活动性结核病筛查时，这2个抗原的检测结果有时会不一致，其原因尚待进一步研究。而且，由于ESAT-6 和CFP-10在MTB潜伏感染时不是高表达蛋白，所以IGRA检测LTBI的敏感性还有待提高［6］。另一个已用于结核诊断的指标——38kD抗原是一种MTB磷酸盐结合蛋白质，早在1989年其诊断价值就已经被人们认识到，但仍然无法有针对性地检测LTBI。
MTB区别于其他大多数病原菌的一个重要特点是其能够在人体中长期存活。处于潜伏期的MTB 可通过调节基因或蛋白的表达而适应不同的外部环境，从而在细菌感染的不同阶段产生不同的抗原。如果用MTB潜伏感染期的某些特异性表达蛋白作为诊断标志物，则有望区分潜伏期和活动期肺结核。目前，热休克蛋白Hsp16.3 和异柠檬酸裂解酶抗原已用于MTB潜伏感染的鉴别诊断，但仅限于血清学诊断，且检测敏感性依然有待提高。
本课题组的早期研究发现lsr2基因是参与MTB在宿主体内长期潜伏感染的全局调控因子。细菌通过去除lsr2基因的阻遏作用，上调多达540个基因的表达以适应宿主内的不利环境，从而达到在人体内长期低水平持续感染的目的［7-9］。为此，我们选取其中受lsr2调控表达量上调较高的Rv3160c（上调表达8.27倍）和Rv2744c（上调表达5.55倍）2个基因，作为潜伏感染鉴别诊断的候选靶基因，通过基因表达和蛋白提纯，获得2个候选蛋白标志物——Rv3160c抗原和35kD抗原。利用C57BL/6小鼠模型分析，确定其免疫原性，并进行了临床样本的血清学诊断潜力评估。
一、研究对象
选取3组不同感染模式人群样本：活动性肺结核组（20例）、MTB潜伏感染组（25例）、正常对照组（24名）。活动性肺结核组包括11例痰涂片阳性患者和9例X线检查具有临床症状的患者，其中男9例、女11例，年龄（65.75±14.82）岁。MTB潜伏感染者是指与结核病患者有长期、连续密切接触（2～8年，平均4.3年），但未显示活动性肺结核临床症状的人群，其中男9例、女16例，年龄（59.42±10.40）岁。正常对照者是指不存在结核病患者密切接触史，无结核患病史或临床结核病症状的人群，其中男11名、女13名，年龄（28.25±10.32）岁。所有研究对象人类免疫缺陷病毒（human immunodeficiency virus，HIV）均为阴性，并有卡介苗接种史。所有样本均委托新疆石河子大学附属医院鉴别、收集，生物医学研究伦理学审查获得该院审核通过。
二、方法
1. 实验抗原的制备 从“Tuberculist”（http：//tuberculist.epfl.ch）中获得Rv2744c、Rv3160c的基因序列。结合pET28a质粒的多克隆位点，进行引物设计（表1）。以MTB H37Rv基因组为模板扩增目的基因序列，重组质粒pET28a-Rv3160c、pET28a-Rv2744c分别转化入大肠埃希菌BL21，涂布在含50 μg/mL卡那霉素的LB平板上，37 ℃培养过夜，随机挑选单克隆接种入LB液体培养基，扩培至1 L。26 ℃培养3 h后加入1 mmol/L 异丙基硫代半乳糖苷（isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside，I P T G），2 6 ℃过夜诱导培养。4 ℃下12 000×g离心10 min收集菌体，重悬于BugBuster蛋白抽提液（美国Novagen公司）中裂解。裂解完成后，裂解液在4 ℃下12 000×g离心20 min，收集上清，和Ni-NTA His·Bind Resin介质（美国Novagen公司）混合加入到空色谱柱中，按照操作手册的流程纯化，获得Rv3160c抗原和35kD抗原。蛋白的纯化和制备过程均在4 ℃下进行，其有效成分为蛋白质，采用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）和基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（matrix-assisted laser desorption/ ionization time of flight mass spectrometry， MALDI-TOF-MS）测定蛋白纯度。阳性抗原ESAT-6及38kD为本实验室纯化表达。
2. 重组蛋白质鉴定 重组蛋白质纯度采用12%SDS-PAGE电泳判断，浓度用Bradford法（美国Sigma公司）确定。
表1 Rv3160c、Rv2744c引物序列
引物 序列（5'～3'）Rv3160cF：CGTGGATCCATGCCGAGGCAGGCCGGCCGCTG R：GCAAAGCTTCTAGAGCCCGCGGTCGGGGGGTGCG Rv2744cF：GCGCATATGATGGCCAATCCGTTCGTTAAAGC R：TATGTCGACCTACTGACCGTAGGGCTGCTCGC
3. 抗原免疫原性分析 将10 μL Rv3160c抗原（浓度为1 mg/mL）和10 μL 35kD抗原（浓度为1 mg/mL）分别与50 μL Freund's 完全/不完全佐剂（美国Sigma公司）充分混合，对C57BL/6小鼠（每组4 只）皮下注射免疫。隔周免疫1次，共免疫3次。首次免疫8周后收集小鼠血清，用酶联免疫吸附试验（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）测定Rv3160c抗原和35kD抗原特异性IgG抗体水平。血清经系列稀释（从1∶400、1∶800、1∶1 600一直到1∶51 200，每次2倍梯度）后加入96孔板，孔中预包被不同待检抗原。使用辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）标记的抗鼠IgG二抗（美国CMCTAG公司）检测抗原免疫原性。
4. 4种纯化抗原在临床血清中的特异性抗体测定 用Rv3160c、35kD、ESAT-6和38kD这4种纯化抗原分别包被酶标板，用收集到的活动性肺结核患者血清、潜伏感染者血清和正常对照者血清作为一抗，1∶100稀释，检测该抗原在不同人群血清中是否有较高的特异性抗体反应，即检测抗Rv3160c抗体、抗35kD抗体、抗ESAT-6抗体和抗38kD抗体水平。
三、统计学方法
采用Graph pad 6进行统计分析。组间比较采用非配对t检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。
一、实验抗原的制备结果
Rv3160c、35kD、ESAT-6和38kD抗原的表达纯化见图1。实验蛋白均以可溶形式表达。经12%SDS-PAGE和MALDI-TOF-MS鉴定，蛋白纯度＞95%。
二、Rv3160c抗原和35kD抗原诱导的特异性抗体的产生
图1 实验用蛋白的表达和纯化
注：（a）Rv3160c蛋白的表达和纯化，1为Marker，2为未经IPTG诱导的全细胞裂解液，3为经IPTG诱导的全细胞裂解液，4为经过Ni柱纯化的Rv3160c蛋白；（b）ESAT-6、35kD、38kD蛋白纯化，1为Marker，2为经过Ni柱纯化的ESAT-6蛋白，3为经过Ni柱纯化的35kD蛋白，4为经过Ni柱纯化38kD蛋白
检测抗原免疫后C57BL/6小鼠血清中IgG （H+L）效价，来评价抗原激起的体液免疫水平。结果显示2个候选抗原均能够引起较高水平的体液免疫反应，血清抗体滴度达1∶25 600，接近阳性参照抗原Ag85A的水平，因此具有作为血清诊断候选抗原的潜力。见图2。
三、血清中4种抗原的特异性抗体水平检测结果
图2 Rv3160c抗原和35kD抗原诱导的特异性抗体水平
注：（a）35kD抗原免疫小鼠血清抗体滴度，
Rv3160c抗原、35kD抗原对不同血清特异性抗体的反应不同。MTB潜伏感染组血清抗Rv3160c抗体和抗35kD抗体水平均明显高于正常对照组（P＜0.01），且抗35KD抗体水平明显高于活动性肺结核组（P＜0.05），但MTB潜伏感染组和活动性肺结核组之间血清抗Rv3160c抗体水平差异无统计学意义（P＞0.05）。MTB潜伏感染组和活动性肺结核组血清抗ESAT-6抗体水平均高于正常对照组（P＜0.01），而MTB潜伏感染组和活动性肺结核组之间差异无统计学意义（P＞0.05）。MTB潜伏感染组血清抗38kD抗体水平明显高于活动性肺结核组和正常对照组（P＜0.05），而活动性肺结核组与正常对照组之间差异无统计学意义（P＞0.05）。见图3。
Rv3160c抗原、35kD抗原在MTB潜伏感染者的血清中产生较强的抗原-抗体反应，与正常对照者的血清反应较弱。35kD抗原在活动性肺结核患者血清中的反应也较弱，其血清反应模式与38kD抗原类似。Rv3160c抗原无法区分活动性肺结核患者和潜伏感染人群，其血清反应模式与ESAT-6接近。
图3 血清中4种抗原的特异性抗体检测结果
注：（a）抗Rv3160c抗体；（b）抗35kD抗体；（c）抗ESAT-6抗体；（d）抗38kD抗体
MTB可能会引起持续几十年的、潜在的、无症状的感染。有5%～10%的潜伏感染个体会发展为活动性疾病，而且宿主的免疫抑制（如HIV混合感染）会明显增加MTB再活化的风险［10］。据世界卫生组织统计，世界上有多达1/3的人口是MTB潜伏感染者，是MTB潜在的再激活和传播的巨大隐患。因此，及时筛查MTB的潜伏感染是非常必要和紧迫的［11］。
虽然迄今为止已经开发出基于38kD、65kD （GroEL2）、Ag85A、ESAT-6、CFP-10和脂阿拉伯甘露聚糖等MTB常用抗原的血清学检测试剂盒［12］，但这些抗原多为细菌培养早期分泌抗原，在MTB进入休眠状态后表达下调，对鉴别诊断长期、潜伏性结核感染几乎无效。因此，目前迫切需要解决的关键问题是鉴定出可区分活动性结核和LTBI的MTB抗原［13］。
在处于MTB持续感染状态的人体中，随着MTB从快速复制状态转变为休眠状态（复制很慢或不复制），MTB的代谢状态以及全基因组表达谱会发生明显改变［14］。目前，已有多个体外研究以低氧和营养饥饿模型模拟休眠状态下MTB表达谱的变化情况，基于“潜伏抗原”开发的诊断试剂应该能够进一步增强MTB潜伏感染的鉴别诊断效果［15］。
Rv3160c抗原属于TetR蛋白家族，是MTB的胞内转录调控蛋白，仅在牛MTB中发现其同源蛋白［16］。35kD抗原是一个富含丙氨酸的细胞壁相关抗原，在MTB临床菌株CDC1551、牛MTB、麻风分枝杆菌和海分枝杆菌等致病性分枝杆菌中保守表达。尽管Rv3160c抗原和35kD抗原在MTB感染过程中的具体作用还不清楚，但这2个抗原都是MTB进入休眠状态后高表达的抗原。C57BL/6小鼠免疫实验显示，Rv3160c抗原和35kD抗原具有较好的免疫原性，能够激发宿主产生与阳性参照抗原Ag85A接近的体液免疫水平，具有良好的免疫反应性。提示它们可能会在MTB潜伏感染者中激起较高水平的体液免疫反应，具有潜伏感染血清学鉴别诊断的潜力。
本研究结果显示MTB潜伏感染组血清抗Rv3160c抗体和抗35kD抗体水平均明显高于正常对照组（P＜0.01），且抗35KD抗体水平明显高于活动性肺结核组（P＜0.05），但MTB潜伏感染组和活动性肺结核组之间血清抗Rv3160c抗体水平差异无统计学意义（P＞0.05）。MTB潜伏感染组和活动性肺结核组血清抗ESAT-6抗体水平均高于正常对照组（P＜0.01），而MTB潜伏感染组和活动性肺结核组之间差异无统计学意义（P＞0.05）。MTB潜伏感染组血清抗38kD抗体水平明显高于活动性肺结核组和正常对照组（P＜0.05），而活动性肺结核组与正常对照组之间差异无统计学意义（P＞0.05）。由此可见，Rv3160c抗原和35kD抗原与MTB潜伏感染者的血清有较强的抗原-抗体反应，而与正常人群血清的反应较弱；35kD抗原与活动性肺结核患者血清反应也较弱，其血清反应模式类似于38kD抗原；Rv3160c抗原无法区分活动性肺结核患者和潜伏感染人群，其血清反应模式与ESAT-6接近。
目前，LTBI诊断中存在的主要问题是还缺乏诊断“金标准”。寻找到能够有效区分活动性结核和LTBI的抗原是解决问题的关键。一直以来，研究者更多地关注DosR调节子、长期低氧反应元件、贫营养状态下分枝杆菌表达上调的基因以及随着细菌从休眠阶段恢复生长时上调表达的复活基因［17］。遗憾的是，除了CFP-10、ESAT-6、Hsp16.3外，上述大部分细菌蛋白标志物的研究均处于实验室探索阶段，尚需大量实验来验证其临床价值。本研究结果显示，Rv3160c抗原和35kD抗原对于MTB潜伏性感染均具有高度特异性，这2个抗原如与现有的对活动性肺结核有高度特异性的抗原结合或先后使用，将有助于提高整体的检测敏感性和特异性，并保持区分活动性结核和LTBI的能力。
总之，寻找和验证具有创新性和自主知识产权的MTB LTBI生物标志物，提高诊断LTBI的敏感性、特异性，可为结核病的早期诊断、预测疾病治疗效果、制定防疫措施提供实验和技术支持。
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The potential of 2 antigens of Mycobacterium tuberculosis for the serodiagnosis of latent tuberculosis infection
SUN Ruifeng1，XIANG Zhihao1，CHEN Fuzeng1，RU Huanwei1，MAI Juntao1，YUAN Li2，LIU Jun1.
（1. State Key Laboratory of Genetic Engineering，School of Life Sciences，Fudan University，Shanghai 200438，China；2. Shihezi University，Shihezi 832002，Xinjiang，China）
Abstract：Objective To investigate the potential of 2 antigens（Rv3160c and 35kD antigens） of Mycobacterium tuberculosis（MTB） highly expressed during latent infection for the serodiagnosis of latent tuberculosis infection（LTBI）. Methods Rv3160c and 35kD antigens were purified，and the immunogenicity was evaluated by C57BL/6 mouse model. MTB antigens，early secretory antigenic target-6（ESAT-6） and 38kD antigens which were in commercial use，were included as positive controls. Serum specificity antibody reactivities of 20 active pulmonary tuberculosis patients，25 LTBI patients（contacting closely with active pulmonary tuberculosis patients for a long time） and 24 healthy subjects were determined using Rv3160c and 35kD antigens. Serum levels of anti-Rv3160c and anti-35kD antibodies were determined. Results Rv3160c and 35kD antigens induced strong humoral immunity in mice. Serum antibody titre reached 1∶256 000，which was close to that of positive control Ag85A. Serum levels of anti-Rv3160c and anti-35kD antibodies in LTBI group were higher than those in healthy control group （P＜0.01）， and serum level of anti-35kD antibody in LTBI group was higher than that in active pulmonary tuberculosis group（P＜0.05）. However，serum level of anti-Rv3160c antibody had no statistical significancebetween LTBI and active pulmonary tuberculosis groups（P＞0.05）. Serum levels of anti-ESAT-6 antibody in LTBI and active pulmonary tuberculosis groups were higher than that in healthy control group（P＜0.01），and there was no statistical significance between LTBI and active pulmonary tuberculosis groups（P＞0.05）. Serum level of anti-38kD antibody in LTBI group was higher than those in active pulmonary tuberculosis and healthy control groups （P＜0.05），but there was no statistical significance between active pulmonary tuberculosis and healthy control groups（P＞0.05）. Both antigens reacted more strongly with sera from LTBI group than sera from healthy control group. The 35kD antigen had a weak reactivity in active pulmonary tuberculosis group，and its pattern of reactivity was similar to that of 38kD antigen. Rv3160c antigen was unable to distinguish active pulmonary tuberculosis and LTBI，and its reactivity pattern was similar to that of ESAT-6 antigen. Conclusions Rv3160c and 35kD antigens are highly specific to LTBI. It is of potential to be used in the diagnosis of LTBI.
Key words：Mycobacterium tuberculosis；Rv3160c antigen；35kD antigen；Latent infection；Serodiagnosis
（收稿日期：2016-03-31）
（本文编辑：龚晓霖）
基金项目：国家科技重大专项（2013ZX10003007003）；上海市自然科学基金项目（16ZR1402800）
作者简介：孙睿峰，男，1991年生，学士，主要从事微生物遗传学研究。
通讯作者：刘 军，联系电话：021-51630571。
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