临床研究
唐 洁1，2，3，陈 策 1，2，4，查 成3，常见荣 3，方 强2，王兆华 5，李柏青1，2
1蚌埠医学院免疫学教研室，2安徽省感染与免疫重点实验室（蚌埠医学院），3蚌埠医学院科研中心，安徽 蚌埠233030，4解放军123医院传染科，安徽 蚌埠 233010，5蚌埠市传染病医院呼吸科，安徽 蚌埠 233010
摘要：目的 研究结核杆菌耐热抗原小分子多肽（Mtb-HAg-10k）刺激人外周血T细胞产生细胞因子肿瘤坏死因子-α（TNF-α）和干扰素-γ（IFN-γ）的作用特点及肺结核患者和潜伏性感染者IFN-γ产生细胞的数量差异，初步探讨Mtb-HAg-10k作为诊断抗原鉴别肺结核和潜伏性结核感染的可行性。方法 以超滤离心法获得的Mtb-HAg-10k为刺激剂作用于人外周血单个核细胞（PBMCs），并以Mtb-HAg、植物血凝素PHA作为对照，用多色流式细胞术检测T细胞亚群中TNF-α和IFN-γ产生细胞比例，酶联免疫斑点法检测肺结核患者和潜伏性感染者PBMCs中IFN-γ产生细胞数量。结果 流式细胞术检测人外周血Mtb-HAg-10k特异性γδT细胞中TNF-α产生细胞比例显著高于IFN-γ产生细胞比例（P＜0.01）；与PHA刺激组相比，γδT细胞中TNF-α和IFN-γ产生细胞比例增高（P＜0.01），而αβT细胞中TNF-α和IFN-γ产生细胞比例显著降低；酶联免疫斑点法检测Mtb-HAg-10k刺激的健康者PBMCs中IFN-γ产生细胞数量低于Mtb-HAg刺激组和PHA对照组（P＜0.01）；肺结核患者IFN-γ产生细胞数量低于潜伏性结核感染者（P＜0.01）。结论 以Mtb-HAg-10K为刺激剂可使人外周血γδT细胞优势产生TNF-α和IFN-γ，通过酶联免疫斑点法检测PBMCs中IFN-γ产生细胞数量差异有助于鉴别肺结核和潜伏性结核感染。
关键词：结核杆菌耐热抗原；γδT细胞；肿瘤坏死因子-α；干扰素-γ；肺结核；潜伏性结核感染
结核杆菌耐热抗原（Mtb-HAg）是将Mtb无毒株H37Ra经121℃热处理后，从菌体胞浆释放到上清液中的一种多肽类抗原，研究证实该抗原可体外特异性激活和扩增人γδT细胞［1-2］。本实验室在前期研究中应用流式细胞术检测发现Mtb-HAg刺激下肺结核（PTB）患者外周血Mtb-HAg特异性γδT细胞中IFN-γ和TNF-α产生细胞比例显著低于结核潜伏感染者（LTBI）和健康者［3-4］而PTB患者和LTBI者外周血总T细胞中两种细胞因子的表达没有显著差异。Mtb-HAg-10k是从Mtb-HAg中提取的相对分子质量在10 000～14 000的小分子成分，在活化人γδT细胞中起主要作用，而Mtb-HAg中的大分子成分则主要激活αβT细胞［1,5］。因此我们推测以Mtb-HAg-10k为刺激剂可能对外周血αβT细胞产生细胞因子的激活作用更弱，从而使IFN-γ和TNF-α更多的来源于γδT细胞。本研究以Mtb-HAg-10k为刺激剂，并以Mtb-HAg、多克隆刺激剂植物血凝素（PHA）作为对照，通过多色流式细胞技术比较刺激后外周血T细胞亚群IFN-γ和TNF-α产生细胞的数量和分布特点，酶联免疫斑点技术（ELISPOT）检测分析PTB患者和LTBI者外周血单个核细胞（PBMC）中IFN-γ产生细胞的数量差异，初步探讨Mtb-HAg-10k作为诊断抗原鉴别PTB和LTBI的可行性。
正常成人外周血采集自蚌埠医学院教职工和学生，年龄21～55岁，近期无感染性疾病史，体检胸部X线检查正常，并排除PTB、肿瘤、自身免疫病等疾病。16例正常人外周血经结核杆菌感染T细胞酶联免疫斑点试剂盒检测，从阳性检测结果筛选出LTBI者6例，其余10例作为健康对照（HC）。具体判断标准［3］：阳性：如阴性对照孔斑点数为0～5个，测试孔A和（或）测试孔B的斑点数减去阴性对照孔斑点数≥6个。如阴性对照孔斑点数≥6个，测试孔A和（或）测试孔B的斑点数必须≥2倍阴性对照斑点数。13例PTB患者外周血来自蚌埠市传染病医院呼吸科，年龄23～61岁，均符合中华医学会结核病学分会2001年《肺结核诊断和治疗指南》中肺结核病诊断标准，且无肿瘤、自身免疫病、艾滋病等其他合并疾病。每份标本均获得本人的知情同意，并且通过蚌埠医学院伦理委员会批准。
APC标记的小鼠抗人CD3单克隆抗体（CD3-APC）及PE标记的小鼠IgG1同型抗体（mIgG1-PE）（Invitrogen）；APC vio770标记的小鼠抗人TCRγδ单克隆抗体（TCRγδ-APC vio770）、FITC标记的小鼠抗人IFN-γ单克隆抗体（IFN-γ-FITC）（Miltenyi Biotec）；莫能霉素（Monensin）、PE标记的小鼠抗人TNF-α（Biolegend）；FITC标记的小鼠IgG1同型抗体（mIgG1-FITC）（天津协科生物技术）；透膜缓冲液（eBioscience）；结核杆菌感染T细胞酶联免疫斑点诊断试剂盒（Human TB IFN-γ precoated ELISPOT kit），产品编号：DKWTB-1002-096（strips）（深圳达科为）；PHA（Sigma）；淋巴细胞分离液（天津灏洋生物科技）；小牛血清（杭州四季青）；染色缓冲液（SB）、封闭液、固定液（2%多聚甲醛）均由本实验室自制。快速液相蛋白分离纯化系统（AKTA Explorer 100）（GE）；流式细胞仪（FACS Verse）（BD）；荧光酶联免疫斑点检测分析仪（S6）（CTL）。
参照文献［6］，从本实验室培养的H37Ra无毒菌株中提取制备Mtb-HAg，将Mtb-HAg通过截留相对分子质量为30 000、10 000、3000超滤管进行离心超滤，收取Mtb-HAg低分子组分，即可通过10 000超滤管，但3000超滤管截留部分，离心收取的上清液经0.22μm微孔滤膜过滤并测定浓度，经快速蛋白液相色谱分析为含10 000～14 000 Mtb-HAg小分子多肽（Mtb-HAg-10k），4℃保存备用。
肝素钠抗凝全血与等体积RPMI 1640培养液混匀，缓慢叠加在淋巴细胞分离液上，2000 r/min，离心15 min。获取PBMC，加入含10%小牛血清的RPMI 1640培养液，1500 r/min，离心10 min后，弃去上清液。用含10%小牛血清的RPMI 1640培养液调整细胞浓度后备用。
调整PBMCs浓度为（1～1.5）×106/mL，取500 μL/孔置于48孔培养板中，。按实验设计分为4组（3复孔/组）：1、阴性对照组：不加任何刺激剂；2、PHA刺激组：加入PHA（终浓度2.5 μg/mL）；3、Mtb-HAg刺激组：加入Mtb-HAg（终浓度10 μg/mL）；4、Mtb-HAg-10k刺激组：加入Mtb-HAg-10k（终浓度10 μg/mL）。各组细胞置于37℃、5%CO2培养箱中培养14 h后，加入高尔基体阻断剂Monensin（终浓度5 μmol/L）继续培养6 h以阻止细胞因子分泌到细胞外。培养结束后收集各组细胞，用SB洗涤2次后，弃上清每管加入500 μL SB重悬细胞，吸取100 μL细胞悬液（约1×105细胞）加入到流式管中，依次加入TCRγδ-APC vio770、CD3-APC进行表面分子染色，混匀后4℃避光反应30 min。每管洗涤1次后，加2%多聚甲醛200 μL固定30 min。，再洗涤1次，尽可能弃上清，加透膜缓冲液100 μL，同时加入3.5 μL封闭液（由小鼠血清和10%牛血清白蛋白按1∶4混合而成）混匀避光30 min，在检测管内加入TNF-α-PE、IFN-γ-FITC作胞内染色，同型对照管中加入等量的同型对照抗体mIgG1-PE和mIgG1-FITC，4℃避光反应30 min。洗涤2次后弃上清，加2%多聚甲醛300 μL重悬细胞，应用流式细胞仪检测样本，检测数据用flowjo软件进行分析。
调整PBMCs浓度为2.5×106/mL，取100 μL/孔加入ELISPOT检测试剂盒中的96孔板内，共计6孔。6孔分别为阴性对照孔：只加细胞培养液，不加任何刺激剂；阳性对照孔：加入PHA（终浓度2.5 μg/mL）；Mtb-HAg孔：加入Mtb-HAg（终浓度10 μg/mL）；Mtb-HAg-10k孔：加入Mtb-HAg-10k（终浓度10 μg/mL）；结核杆菌抗原A孔（加MTB特异性混合多肽A 10 μL）；结核杆菌抗原B孔（加MTB特异性混合多肽B 10 μL）。将细胞悬液置于5%CO2、37℃培养箱内培养20 h后，每孔加入4℃去离子水200 μL 10 min以裂解细胞；每孔加入200 μL洗涤液洗板5次，每孔加入100 μL生物素标记的抗人INF-γ抗体孵育1 h；洗板5次，每孔加入100 μL辣根过氧化物酶标记的酶联亲和物孵育1 h。洗板5次，每孔加入显色底物液100 μL，室温避光放置25 min。加入去离子水洗板2次中止显色。检测板放置在通风处自然晾干。荧光酶联免疫斑点检测分析仪（S6）进行斑点计数和数据分析。
各实验组数据以均数±标准差表示，使用SPSS18.0软件进行处理，采用方差分析和q检验，P＜0.05具有统计学意义。
流式细胞术检测γδT细胞产生细胞因子TNF-α和IFN-γ水平，结果显示 Mtb-HAg-10k特异性γδT细胞中TNF-α产生细胞和IFN-γ产生细胞比例分别为（13.41±3.01）%，（7.18±1.77）%显著高于PHA对照组［（6.99±3.23）%，（2.62±1.64）%，P＜0.01］；而Mtb-HAg-10k特异性αβT细胞中TNF-α产生细胞和IFN-γ产生细胞比例分别为（0.15±0.17）%，（0.06±0.04）%显著低于PHA对照组［（3.65±1.33）% ，（0.61±0.28）%，P＜0.01］，Mtb-HAg-10k特异性αβT细胞中IFN-γ产生细胞比例（0.06±0.04）%显著低于 Mtb-HAg刺激组［（0.14±0.03）%，P＜0.01］，Mtb-HAg-10k刺激下αβT细胞中TNF-α产生细胞比例与Mtb-HAg刺激组、阴性对照组均无显著性差异（图1、2）。
图1 不同刺激剂作用下外周血γδT和αβT细胞中TNF-α产生细胞比例
Fig.1 Proportion of TNF-α-producing cells in γδT and αβ T cells following different stimulations.
Mtb-HAg-10k组和Mtb-HAg组在γδT细胞中TNF-α产生细胞的比例分别为（13.41±3.01）%，（15.86±4.15）%均显著高于IFN-γ产生细胞比例［（7.18±1.77）%，（9.18±3.40）%，P＜0.01］；PHA组αβT细胞中产生TNF-α细胞比例（3.65±1.33）%显著高于产生IFN-γ细胞比例［（0.61±0.28）%，P＜0.01］，而Mtb-HAg-10k组和Mtb-HAg组αβT细胞中TNF-α产生细胞比例（0.15±0.17）%，（0.25±0.14）%与同组 IFN-γ产生细胞比例（0.06±0.04）%，（0.14±0.03）%比较，均无显著性差异（P＞0.05）。
图2 不同刺激剂作用下外周血γδT和αβT细胞中INF-γ产生细胞比例
Fig.2 Proportion of INF-γ-producing cells in γδT and αβT cells following different stimulations.
图3 不同刺激剂作用下γδT中共表达TNF-α和INF-γ的细胞比例
Fig.3Proportion of INF-γ-and TNF-α-producing cells in γδT cells following different stimulations.
在Mtb-HAg组、Mtb-HAg-10k组、PHA组中γδT细胞共表达TNF-α和IFN-γ的比例分别为：（8.05±3.09）%，（6.21±1.78）%，（1.93±1.42）%，三组IFN-γ+γδT细胞中同时表达TNF-α的细胞比例分别是：（85.82±6.43）%，（87.47±7.13）%，（69.64±16.58）%，Mtb-HAg-10k 组、Mtb-HAg组显著高于PHA组（P＜0.05），Mtb-HAg组与Mtb-HAg（10k）组之间的差异无统计学意义（P＞0.05，图3）。
分别以Mtb-HAg-10k、Mtb-HAg、PHA为刺激剂作用于PBMCs 20 h后，应用ELISPOT技术检测PBMCs中IFN-γ产生细胞数量。结果显示，同一群体中Mtb-HAg-10k组IFN-γ产生细胞数均显著低于PHA刺激组（P＜0.01）和Mtb-HAg刺激组（P＜0.01）。Mtb-HAg-10k刺激下肺结核患者PBMCs中IFN-γ产生细胞数显著低于LTBI者（P＜0.01）和HC（P＜0.01），而在Mtb-HAg组、PHA刺激组各人群间没有差异（P＞0.05，表1）。
表1 不同人群PBMCs中IFN-γ产生细胞数量
Tab.1 Number of IFN-γ-producing cells in PBMCs from different subjects
**P＜0.01 PTB(pulmonary tuberculosis)vs HC(Health Control)and LTBI(latent tuberculosis infection).
γδT细胞是表达TCRγδ的一类特殊T细胞亚群，约占人外周血T淋巴细胞总数的5%，它识别抗原没有MHC限制性，经嗜乳脂蛋白（BTN）3A1等分子递呈的磷酸类抗原刺激而被快速活化增殖［7-8］，可通过释放穿孔素和颗粒酶等细胞毒性物质直接杀伤靶细胞［9-10］，也可通过分泌细胞因子发挥免疫调节作用［11］，因此γδT细胞能较αβT细胞更早更迅速在感染性疾病免疫应答中发挥关键作用［12-13］。研究发现在抗结核感染免疫中TNF-α和INF-γ是两种关键细胞因子［14-15］，而γδT细胞是其重要来源细胞［16-17］。
目前体外活化扩增γδT细胞的刺激剂主要是磷酸类抗原［18］。本实验室及其他研究者证实Mtb-HAg也可使人外周血γδT细胞活化增殖［1,19］。其作用方式可能是通过与TCRγδ直接结合诱导TCRγδ分子发生局部聚集化，导致功能性脂筏形成并促进Src蛋白激酶及其下游的信号分子快速活化从而激活γδT细胞［20］。其中刺激人γδT细胞增殖的活性成分主要存在于相对分子质量在10 000～14 000之间，非分泌性、对蛋白水解酶敏感的小分子多肽中［1,21］，即Mtb-HAg-10k。本研究中我们通过流式细胞术检测发现Mtb-HAg-10k可优势诱导人γδT细胞产生TNF-α和INF-γ，这与我们前期关于Mtb-HAg的研究结果一致［4,22］。进一步比较Mtb-HAg-10k刺激下αβT细胞中IFN-γ产生细胞比例显著低于Mtb-HAg刺激组，Mtb-HAg-10k刺激下αβT细胞中TNF-α产生细胞比例与Mtb-HAg刺激组、阴性对照组均无显著性差异，这提示着以Mtb-HAg-10k为刺激剂不但能象Mtb-HAg一样使γδT细胞优势产生IFN-γ和TNF-α，同时由于它不含有优势激活αβT细胞的Mtb-HAg大分子组分，从而使得Mtb-HAg-10k诱导的产生TNF-α和IFN-γ的T细胞更多的来源于γδT细胞。
本研究中我们通过流式细胞术检测分析发现Mtb-HAg-10k刺激组总T细胞中TNF-α和IFN-γ产生细胞比例与Mtb-HAg刺激组相比没有显著性差异，这可能与TNF-α和IFN-γ产生细胞在总T细胞中所占比例太少有关（0.40%～1.05%）。但通过ELISPOT技术检测结果显示Mtb-HAg-10k刺激下正常人群PBMCs中分泌IFN-γ细胞数量显著低于Mtb-HAg和PHA刺激组，这是由于ELISPOT比流式细胞术具有更高检测灵敏度（可达到1/104细胞），使得Mtb-HAg-10k和Mtb-HAg刺激下的斑点形成细胞数量差异明显具有统计学意义。
近年来，IFN-γ释放试验已被广泛用于MTB感染的诊断，可用于评估人群中MTB感染率［23-24］。其中结核感染T细胞斑点试验（T-SPOT.TB）就是应用ELISPOT技术检测经结核杆菌特异性抗原ESAT-6或CFP-10刺激后产生IFN-γ的效应性或记忆性αβT细胞数量的方法来判断受试者是否感染MTB，但无法有效区分PTB和LTBI。本研究中我们以Mtb-HAg-10k为刺激剂应用ELISPOT技术检测PTB患者PBMCs中IFN-γ分泌细胞数量显著低于LTBI和HC，这一现象可能与PTB患者γδT细胞在结核分枝杆菌的反复刺激下导致的细胞凋亡和功能异常有关［25］。
综上所述，我们的研究结果表明Mtb-HAg-10k可特异性诱导人外周血γδT细胞产生TNF-α和IFN-γ，应用ELISPOT技术检测Mtb-HAg-10k刺激下PTB患者IFN-γ产生细胞数量显著低于LTBI。这提示基于ELISPOT技术的Mtb-HAg-10k特异性IFN-γ释放试验可有助于区分PTB和LTBI。
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（编辑：吴锦雅）
Peripheral blood T cell TNF-α and IFN-γ production stimulated by low molecular peptide of Mycobacterium tuberculosis heat-resistant antigen for differential diagnosis between pulmonary tuberculosis and latent tuberculosis infection
TANG Jie1,2,3,CHEN Ce1,2,4,ZHA Chen3,CHANG Jianrong3,FANG Qiang2,WANG Zhaohua5,LI Baiqing1,2
1Department of Immunology,2Anhui Provincial Key Laboratory of Infection and Immunity,3Science Research Center,Bengbu Medical College,Bengbu 233030,China;4Department of Infectious Disease,123 Hospital of PLA,Bengbu 233010,China;5Department of Respiratory Medicine,Bengbu Infection Hospital,Bengbu 233010,China
Abstract:Objective To investigate the effects of low molecular peptide of Mycobacterium tuberculosis heat-resistant antigen(Mtb-HAg-10k)on the production of tumor necrosis factor-α (TNF-α)and interferon-γ (IFN-γ)in peripheral blood T cells and test the feasibility of differential diagnosis between pulmonary tuberculosis(PTB)and latent tuberculosis infection(LTBI)by assessing the number of Mtb-HAg-10k-stimulated IFN-γ-producing T cells.Methods Peripheral blood mononuclear cells(PBMCs)were separated from the peripheral blood of 10 healthy adults,6 individuals with LTBI and 13 patients with PTB.The PBMCs were cultured in the presence of Mtb-HAg-10k obtained by ultrafiltration centrifugation,with Mtb-HAg and phytohaemagglutinin(PHA)as the controls.The proportions of TNF-α-and IFN-γ-producing cells in the T cell subsets were detected by flow cytometry(FCM),and the number of IFN-γ-producing cells from patients with PTB and LTBI was detected with ELISPOT.Results Flow cytometry showed that Mtb-HAg-10k exposure resulted in a significantly higher proportion of TNF-α-producing γδT cells than that of IFN-γ-producing γδT cells in the PBMCs(P＜0.01).Compared with the PBMCs exposed to PHA,the PBMCs exposed to Mtb-HAg-10k exhibited a significantly greater proportion of γδT cells that produced both TNF-α and IFN-γ (P＜0.01)but a significantly lower proportion of αβT cells producing both TNF-α and IFN-γ (P＜0.01).Mtb-HAg-10k exposure of the PBMCs caused a significant reduction in the number of IFN-γ-producing cells as compared with Mtb-HAg and PHA treatments(P＜0.01),and this reduction was more obvious in PBMCs from patients with PTB than in those from individuals with LTBI (P＜0.01).Conclusion Mtb-HAg-10k can markedly induce γδT cells in the PBMCs to produce TNF-α and IFN-γ,and detection of the number of IFN-γ-producing cells in the PBMCs following Mtb-HAg-10k stimulation helps in the differential diagnosis between pulmonary tuberculosis and latent tuberculosis infection.
Keywords:Mycobacterium tuberculosis heat resistant antigen; γδT cells;tumor necrosis factor-α;interferon-γ;pulmonary tuberculosis;latent tuberculosis infection
收稿日期：2017-03-05
基金项目：安徽高校科研平台创新团队项目（2016-40）；安徽高校省级科研项目（KJ2011Z248）；蚌埠医学院科技发展基金（BYKF1402）
作者简介：唐 洁，副教授，E-mail:bbmctangjie@foxmail.com，陈 策，硕士研究生，E-mail:604190467@qq.com。唐 洁、陈 策共同为第一作者
通信作者：李柏青，教授，博士，E-mail:baiqingli@bbmc.edu.cn
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