以PD-1抗体和CAR-T技术为代表的肿瘤免疫治疗已经创造了很多奇迹，比如美国前总统卡特的脑转移黑色素瘤细胞消失了，身患急性淋巴细胞白血病的5岁女孩Emily在多次复发之后通过CAR-T技术痊愈了，国内也有恶性黑色素瘤、肝癌和肺癌的部分患者使用PD-1抗体之后有非常好的效果。肿瘤免疫治疗技术还有很多：除了PD-1抗体，还有很多别的靶点的抗体正在开发中，比如CD47、4-1BB、KIR等;除了CAR-T技术，还有CAR-NK、TCRT和TIL等，都是新的希望。菠菜君详解一下TIL细胞疗法。
什么是TIL细胞疗法
TIL(Tumor infiltrating lymphocytes)是指肿瘤浸润的淋巴细胞。手术切除的肿瘤组织，大部分是肿瘤细胞，也有少部分淋巴细胞。科学家可以通过一些培养方法把这些肿瘤组织中的淋巴细胞扩增起来。这些淋巴细胞中有些是能够杀伤肿瘤细胞的，但是由于一些原因(比如肿瘤微环境和PD-1)，他们的功能受到了抑制，不能在肿瘤组织中有效的杀伤肿瘤细胞。如果利用一些方法把这些淋巴细胞富集起来，大量回输给患者，或许就能对患者有利。如果能够再联合PD-1或者别的疗法比如放疗，效果可能会更好。基于这些想法，TIL细胞疗法逐步发展。这项技术的推动者是NIH的Rosenberg，做了很多的研究和临床。
TIL细胞治疗的流程
简单说就是从手术切除的肿瘤组织(1-2mm3)中分离扩增TIL细胞，扩增出来的细胞主要是CD4和CD8 T细胞，然后体外培养一段时间得到足够多的TIL细胞;患者在进行回输之前会进行化疗，这一步很关键，现在国内的CAR-T治疗也会在回输CAR-T细胞之前进行化疗;然后回输TIL细胞，同时回输IL-2(720,000 IU/kg)。
具体的操作流程如下图：
TIL细胞治疗的临床数据
从1998年开始，已经有很多患者接受了TIL细胞治疗，主要都是恶性黑色素瘤的患者，下面一个图总结了这些临床试验的结果：针对恶性黑色素瘤的几个临床有效率都很高，甚至达到56%;还有针对宫颈癌的，只有9位患者，3位有效;一位针对胆管癌肝转肺转的患者，使用了寻找neoantigen特异的TIL的方法，现在已经完全缓解，真是奇迹。
接着具体说说上图中2011年的这93位患者的具体细节。这些患者来自三个临床试验，总共93位患者：32名患者PR(肿瘤缩小至少30%)，20名患者CR(肿瘤消失,占20%)，总的ORR是56%，五年生存率29%。看一下亚组分析，会发现同时配合一定剂量的放疗效果会更好(TBI=Total Body Irradiation，全身放疗);还有11位CTLA-4抗体治疗失败的患者，经过TIL细胞回输之后，5年生存率可能会达到44%，太惊艳了，具体如下图。
现在搜索clinicaltrial可以看到有不少关于TIL细胞疗法的临床，大部分都是针对黑色素瘤的，少数针对其它癌症比如卵巢癌等，有些是和其他的治疗手段比如一些靶向药(威罗菲尼)连用等正在进行中，期待这项技术会带来更好的结果，有新的数据我们也将会继续报道。在此菠菜君也提醒患者：TIL技术目前仅仅是被证明在黑色素瘤中效果不错，扩大到其它癌症的数据还不充分，大家一定要谨慎选择;TIL细胞治疗和国内的一些传统的很神奇的细胞疗法并不一定一样，可能名字一样，慎重。国外的KFC可能吃起来和国内也不是一个味。
什么样的TIL细胞才是有效的?
按照Rosenberg的TIL细胞的治疗流程，回输的TIL细胞其实是很多细胞的混合体，并没有经过很特异的筛选。有些TIL细胞是对肿瘤特异的，有些并不是特异的。科学家们总是喜欢刨根问底，也是为了提高有效率，Rosenberg接下来研究了一下这些混合的细胞里到底哪种特定类型的细胞才是肿瘤特异的，于是就做了如下探索：第一是通过基因测序寻找肿瘤细胞特异的突变蛋白，然后筛选针对这个突变的特异TIL细胞，回输，临床效果很好，已经治愈了一位肝肺转移的胆管癌的患者，不过这种疗法太过个性化，普及起来太难太难，花费只有天知道;第二是通过一些筛选，寻找肿瘤特异的TIL细胞具有什么特殊的表面标志物，没有第一种探索那么精准，但是也很有可能会进一步提高效果，这种方法仅仅是开始，还没有临床数据。
寻找肿瘤特异的TIL细胞—neoantigen
肿瘤细胞是有很多的基因水平的突变，一些基因突变最终会造成蛋白质的氨基酸序列改变。比如说，一个蛋白ERBB2IP(菠菜也不造这个蛋白具体啥功能，他有没有功能也不重要的，关键是他发生了突变)在正常细胞的一段氨基酸序列是NSKEETEHLENGN，在肿瘤细胞中经过测序发现这段序列变成了NSKEETGHLENGN，一个氨基酸从E变成了G，这是一个突变。不过，对于免疫系统来说，这样的突变是就是一个靶点，它会认为这个细胞不正常了，需要清除它，所以免疫系统会调兵遣将入侵到肿瘤组织中杀死肿瘤细胞。不过，很遗憾，肿瘤细胞也不是吃素的，会有各种办法逃脱，比如表达PDL1或者依靠肿瘤微环境。最后的结果可能就是：这些针对从E到G的突变的淋巴细胞在肿瘤组织中和肿瘤细胞共存，它们成了TIL细胞。要是能够单一的回输这种针对肿瘤突变的TIL细胞，效果可能会更好。下面是这种技术的具体流程：
这个E到G的突变就产生了一个neoantigen，将来可能大有可为。而且，已经有针对neoantigen的RNA疫苗在临床试验，而且是同时针对多个靶点的RNA疫苗。不过这里的问题是：这个筛选neoantigen的过程花费太大，很难产业化，至少目前来看。
国外的那位胆管癌肝转肺转的患者Melinda经过上图的步骤找到了针对neoantigen特异的TIL细胞，经过回输之后，肿瘤消失了。下面是她们夫妻的照片，祝福他们长久有效。
寻找肿瘤特异的TIL细胞—PD-1阳性的TIL才是有效的TIL?
除了如上图中通过一堆复杂的方法寻找neoantigen特异的TIL细胞外，还可以有另一个思路：根据培养出来的TIL细胞表达的蛋白不同，把他们分成阳性和阴性的细胞群，然后分别研究不同细胞群的的功能。Rosenberg做了这样的探索，将TIL细胞分成PD-1阳性的和PD-1阴性的两群，然后研究他们的功能。除了PD-1，还研究了LAG-3/TIM-3/4-1BB分子。最后发现，在体外试验系统中，PD-1阳性的细胞比PD-1阴性的细胞对肿瘤细胞的杀伤能力更强。简单数据如下图：
但是，这种筛选的方法还是在初步的探索阶段，并没有临床试验的支持。搜索clinicaltrials网站，会发现有一个通过筛选4-1BB阳性的TIL细胞治疗转移的黑色素瘤的临床试验在招募(NCT02111863)，希望有好的结果出来。
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参考文献：
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2 Rosenberg SA etal. Durable complete responses in heavily pretreated patients with metastatic melanoma using T-cell transferimmunotherapy. Clin Cancer Res. 2011 Jul 1;17(13):4550-7
3 Tran E etal. Cancer immunotherapy based on mutation-specific CD4 T cells in a patient with epithelial cancer. Science. 2014 May 9;344(6184):641-5
4 Gros A etal. PD-1 identifies the patient-specific CD8? tumor-reactive repertoire infiltrating human tumors. J Clin Invest. 2014 May;124(5):2246-59
5 Tran E etal. Immunogenicity of somatic mutations in human gastrointestinal can cers. Science. 2015 Dec 11;350(6266):1387-90
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