Nature | 刘晓东等揭示单细胞水平人成熟皮肤纤维细胞重编程的细胞命运调控轨迹并发现人诱导滋养层干细胞 ​

先前，人类胚胎的发育（从不成熟胚胎多能干细胞分化形成成熟体细胞）被认为是单向不可逆的过程。然而，山中伸弥和约翰·格登的团队分别通过'体细胞重编程技术’证实终末分化的体细胞也能够转变为多能干细胞，从而彻底改变了人们对细胞和器官生长的理解【1】，他两人因此荣获2012年诺贝尔生理学或医学奖。

 

利用转录因子，人体成熟体细胞可以被重编程为类似于早期胚胎多能干细胞的状态，即：胚胎着床前的原始态(Naive) 和着床后的始发态(Primed)。诱导多能干细胞（iPS cell）具有倍增能力和分化成胚胎内各种细胞的的能力（除了外胚胎组织细胞），在疾病病理研究，药物筛选和细胞疗法等领域表现出了巨大价值【2,3】。但是，成熟体细胞到诱导多能干细胞的单细胞水平分子路线图仍未被系统的研究，这阻碍了人们对体细胞重编程过程中细胞命运调控机制的深入理解，并限制了体细胞重编程技术进一步优化和应用。 

近日，澳大利亚莫纳什大学（Monash University）Jose M.Polo团队联合杜克—新加坡国立大学Owen J.L. Rackham团队（共同一作为刘晓东博士，John F. Ouyang和FernandoJ. Rossello博士）在Nature杂志上发表了题为Reprogramming roadmap reveals route to human induced trophoblast stem cells 的文章，该工作利用单细胞转录组学技术揭示了人皮肤成纤维细胞重编程的细胞命运调控轨迹，该研究发现体细胞重编程为原始态(Naive) 和始发态(Primed) 多能性细胞遵循不同的、独特的轨迹。最重要的是，利用对编程机制的理解，作者研发了一种新方法来创建诱导滋养层干细胞(induced trophoblast stem cells, iTSCs)。

 

 

作者首先采用了无整合仙台病毒来递送转录因子OCT4(也称为POU5F1)、KLF4、SOX2和MYC从而完成了重编程过程，并收集了重编程过程中不同时间点的细胞以及完成重编程的诱导多能干细胞。随后采用单细胞测序技术在单细胞水平上研究了不同组别的重编程路径(图1a)。作者利用多种生信分析方法确定了细胞种类，构建了体细胞重编程到原始态 (Naive) 和始发态 (Primed)诱导多能干细胞的轨迹（图1b-g）。作者得出一个重要结论，即体细胞重编程到原始态(Naive) 诱导多能干细胞的轨迹不同于重编程到始发态(Primed)的轨迹，并且原始态(Naive)并不仅仅是始发态(Primed)轨迹的延伸。这说明体细胞重编程到原始态(Naive)并不需要经过始发态(Primed)的诱导过程。

 

图1.体细胞重编程实验方案及路线图分析。

 

作者进一步研究了重编程过程中细胞命运的转变过程中表观基因组的动态重组。利用一种检测染色质开放性的测序方法（ATAC-seq）, 作者比较了基因组调控序列（包括增强子，启动子，绝缘子等）在两个重编程路径中的区别并对结果进行了模糊聚类，得到了八个簇 (标记为C1-C8)，并详细描述了随着时间推移，染色质可及性的整体变化轨迹（图2d）。此外，作者还发现C7和C8两个簇显示出未预料到的、显著的滋养外胚层(Trophectoderm, TE) 相关转录因子(例如，TFAP2C和GATA2) motif的富集，并且这些转录因子在重编程至Naive状态的过程中被特异性上调而在Primed状态下被瞬时上调。同时作者还证明：这些不同的转录调控过程可能控制着Naive和Primed的重编程分支。

 

图2. 体细胞重编程表观组动态

 

作者发现在体细胞重编程到原始态(Naive)多能干细胞的单细胞轨迹中，一个细胞亚群被高度富集，形成了一个“新的中间群”，同时其相应的特征（“新的中间特征”）在体内人囊胚的TE谱系中高度富集。作者随后发现，这一TE相关的细胞群可以稳定产生滋养层干细胞(Trophoblast stem cells, TSCs)。作者将Naive重编程21天的细胞转移到最近报道的人TSC培养基中【4】，并观察到了形态学上类似于人类胚胎或者妊娠前三个月的胎盘的滋养层干细胞（TSCs），将其命名为“诱导性TS细胞”(iTSCd21n)。iTSCd21n能够表达人TE和TS细胞的关键标记（如P63、TFAP2C、GATA2和KRT7）。与此同时， iTSCd21n可分化为以SDC1阳性多核细胞为特征的合胞体滋养层细胞并高表达人类的主要组织相容性复合体HLA-G的绒毛外滋养层细胞。iTSCd21n合胞体滋养层细胞显示出明显高于iTSCd21n的融合指数，并分泌人绒毛膜促性腺激素(hCG)。作者还证实TSCd21n的可在小鼠体内移植和分化。这些体外和小鼠体内的实验结果证明了iTSCd21n是具备分化为胎盘的主要滋养层谱系细胞类型的能力的。

 

最后，作者证实成熟体细胞可以直接被诱导成滋养层干细胞。作者发现，直接利用重编程第8天细胞可以更有效地衍生iTS细胞系(iTSCd8)。这些iTSCd8具备倍增能力而且表达单核滋养层的关键标记基因，并且可以在体外分化为合胞体滋养层和绒毛外滋养层。最后，作者证实iTSCd8在小鼠体内可分化为胎盘的主要滋养层谱系细胞类型，并在尿液和血清中检测到分泌的hCG(图3)。以上结果证实直接来源于成体皮肤细胞的iTSCd8在分子和功能层面与原代TS细胞相似。

                       

 图3. 成熟体细胞可以直接被诱导成滋养层干细胞。

 

综上，作者在单细胞水平上，构建了人成熟皮肤纤维细胞重编程到为原始态(Naive) 和始发态(Primed)多能性的细胞命运调控轨迹。揭示了两种重编程轨迹的分支，并且发现细胞不需要首先获得Primed多能性状态来重编程为Naive多能性状态。在体细胞重编程到原始态(Naive)诱导多能性的过程中，作者发现了滋养外胚层转录因子、细胞亚群的富集，利用这个发现，做出了滋养层干细胞。作者进一步研发了一种新方法来创建直接来源成熟体细胞的诱导滋养层干细胞。作者的研究促进了利用诱导滋养层干细胞在体外理解和干预早期人类发育性疾病的能力，同时诱导多能干细胞和滋养层干细胞将帮助我们了解他们的互相影响，并进一步提高体细胞重编程技术在临床医学的应用。

 

Polo实验室（https://www.monash.edu/discovery-institute/polo-lab/home）诚邀具有干细胞、胚胎发育学,或生物信息学背景的博士生加入团队，有意者请发简历到[e-mail]

 

原文链接：

https://doi.org/10.1038/s41586-020-2734-6

制版人：schweine

参考文献

1. Holmes,D. Stem cell scientists share 2012 Nobel Prize for medicine. Lancet 380, 1295(2012).

2. Nichols,J. & Smith, A. Naive and primed pluripotent states. Cell Stem Cell 4,487–492 (2009).

3. Robinton,D. A. & Daley, G. Q. The promise of induced pluripotent stem cells inresearch and therapy. Nature 481, 295–305 (2012).

4. Okae,H. et al. Derivation of Human Trophoblast Stem Cells. Cell Stem Cell 22,50–63.e6 (2018).