专利名称一种快速高效分离和纯化重组
腺病毒相关病毒的方法和用途的制作方法
技术领域本发明属于生物技术领域。具体涉及重组
腺相关病毒的分离、浓缩和纯化方法，尤其适合大规模制备重组AAV病毒以用于
基因转移和
基因治疗。
病毒载体在基因转移和基因治疗中有广泛的应用。其中腺相关病毒(Adeno-associatedvirus，AAV)因具有无致病性、理化性质稳定、
免疫原性弱、可定点整合到
真核细胞染色体中从而介导外源基因的长期稳定表达等特点而越来越受到关注，在基因转移和基因治疗领域具有广阔的应用前景。
人2型腺相关病毒(AAV-2)是目前最常用作病毒载体的腺相关病毒。AAV病毒为
辅助病毒依赖性病毒，其感染复制需要腺病毒或
单纯疱疹病毒等的辅助。
AAV-2病毒的颗粒直径为20～24nm，为20面体结构。病毒由20～25％ DNA和75％～80％蛋白质组成。在
氯化铯溶液中的
浮力密度为1.41g/cm3。
基因组为4.7kb的
单链DNA。基因组两端各有一段145bp的重复序列(ITR)，是AAV病毒特有的
顺式作用元件，为AAV病毒的复制、整合、拯救、包装等所必需。ITRs之间为AAV的编码基因，左边的为rep基因，编码4种Rep蛋白Rep78，Rep68，Rep52，Rep40；右边的为cap基因，编码3种外壳蛋白VP1，VP2，VP3，分子量依次为87，72，62 KDal。AAV病毒颗粒中VP3、VP2、VP1蛋白的比例约为10∶1∶1。
Samulski RJ等(Cloning of adeno-associated virus into pBR322rescue of intact virusfrom the recombinant plasmid in human cells，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，792077-2031，1982)将完整的双链AAV
DNA克隆于pBR322质粒中，发现位于质粒中的AAV
前病毒基因组亦具有形成感染性病毒的能力。因此将外源
基因表达单位置于AAV病毒的两个ITR之间，而rep和cap基因及辅助病毒的功能则由其它方式反式提供，在细胞中可获得含有外源基因的重组AAV病毒。
重组腺相关病毒(recombinant adeno-associated virus，rAAV)颗粒的结构与
野生型AAV相同。所不同的是，重组AAV病毒颗粒包装的基因组为单链的两端带有AAV ITR序列的
外源DNA。重组AAV病毒中可容纳的外源DNA长度在5.0kb以内。
经典的rAAV产生方法(Xiao Xiao，Richard Jude Samulski Current Protocols in HumanGenetics，Vectors for Gene Therapy，Unit 12.1，1996)是用双质粒
共转染293细胞以及辅助病毒如5型腺病毒(Ad5)感染。双质粒中一个是重组AAV载体质粒，另一个为含有AAV rep-cap基因的辅助质粒。由于这种方法操作较复杂，影响rAAV产生的因素多，难以获得高滴度的rAAV，不易于扩大生产规模。因此许多研究者致力于改进重组AAV病毒(rAAV)的产生方法。这些改进包括以下几类1)将repcap基因转导到细胞株中，建成一种包装细胞系。其中的repcap的表达受其自身的启动子控制(KenjiTamayose，Yukihiko Hirai，and Takashi Shimada，A new strategy for large-scale preparation ofhigh-titer recombinant adeno-associated virus vectors by using packaging cell lines andsulfalonated cellulose column chromatography， Human Gene Therapy 7507-513，1996)，或换成其它组成型或可诱导启动子(Inoue N，Russell DW.Packaging cells based on induciblegene amplification for the production of adeno-associated virus vectors.J.Virol 727024-7031，1998)；2)将AAV ITRs和其间的外源基因表达单位DNA插入腺病毒基因组中，构建成一种嵌合型重组腺病毒(Guang-Ping Gao，Guang Qu et al.High-titer adeno-associatedviral vectors from a rep/cap cell line and hybrid shuttle virus Human Gene Therapy 92353-2362，1998；Liu XL，Clark KR，Johnson PR Production of recombinant adeno-associatedvirus vectors using a packaging cell line and a hybrid recombinant adenovirus.Gene Ther 1999Feb；6(2)293-9)。3)将AAV ITRs和其间的外源基因表达单位DNA置于自主复制的EBV病毒载体中，转导至细胞中，建成一种携带具有自主复制能力的重组AAV载体质粒的细胞株(颜子颍，姚二梅等，以EBV复制子为基础的新型重组AAV载体包装系统，科学通报，42(17)1860-1863，1997)。4)将repcap基因插入腺病毒基因组中，构建成一种具有完全辅助功能的重组腺病毒。然而许多实验证明，这种思路难以实现。可能是由于rep蛋白对腺病毒的强烈抑制作用使得含有repcap基因的重组腺病毒无法产生。5)用HSV病毒扩增子携带repcap基因，产生具有完全辅助功能的HSV混合病毒(James E.Conway，Sergei Zolotukhin et al.Recombinant adeno-associated virus type 2 replication andpackaging id entirely supported by a herpes simplex virus type 1 amplicon expressing rep andcap，J Vorol 71(11)8780-8789，1997；舒跃龙，吴小兵，杨天忠，贡惠宇，侯云德，颜子颍 以HSV-1扩增子载体构建的新型重组AAV载体包装系统 中国科学(C辑)28(5)457-462，1998)。6)rAAV病毒体外包装(无细胞包装)(Zhou XH，MuzyczkaN.Invitropackaging of adeno-associated virus DNA，J Virol 72(4)3241-3247，1998)。
我们曾提出了“一株载体细胞/一株辅助病毒”的生产策略(中国专利申请号98120033.8，及99119039.4，伍志坚，吴小兵等 具有AAV载体包装功能的重组HSV的产生，科学通报44(5)506-509)用携带了AAV病毒rep-cap基因的重组HSV-1病毒(HSV1-rc)感染稳定整合了重组AAV载体DNA的载体细胞株，从病变的细胞中可获得大量的rAAV病毒。用rHSV-rc病毒感染载体细胞株时，HSV1-rc病毒进入细胞后其DNA大量复制并最终产生子代病毒。HSV1-rc病毒DNA复制时携带的rep-cap基因亦同步复制，从而产生高拷贝的rep-cap基因。Rep基因编码产生4种Rep蛋白(Rep78，Rep68，Rep52，Rep40)，使重组AAV载体DNA从细胞基因组上拯救出来并大量复制最终成为单链被包装到AAV壳粒中；cap基因编码3种外壳蛋白VP1，VP2，VP3，在细胞核内组装成壳粒。该方法有效地解决了rAAV的大规模产生问题。
研究中我们发现，用重组HSV-1病毒HSV1-rc感染未转染AAV载体DNA的BHK-21细胞，也可以产生大量AAV病毒颗粒。只是这种病毒颗粒为病毒空壳。说明AAV病毒形成病毒颗粒时是预装好病毒空壳后再将基因组DNA包裹到壳粒中。
如何高效地分离和纯化大量的rAAV是其应用的又一个关键问题。目前有关重组AAV分离和纯化的报道较少。传统的纯化方法采用硫酸铵分步盐析法将rAAV与细胞碎片分离并使之浓缩，然后用2～3轮氯化铯梯度超离心获得rAAV组分，最后用透析方法除去氯化铯和其它盐。这种方法既费时费力，又使rAAV的感染性有较大的损失，且回收率低。因此，许多研究者致力于发展新的纯化方法。近年来报道的柱层析方法(KenjiTamayose，Yukihiko Hirai，and Takashi Shimada，A new strategy for large-scale preparation ofhigh-titer recombinant adeno-associated virus vectors by using packaging cell lines andsulfalonated cellulose column chromatography，Human Gene Therapy 7507-513，1996；SZolotukhin，Bj Byrne et al.Recombinant adeno-associated virus purification using novelmethods improves infectious titer and yield.Gene Therapy 6973-985，1999；Dirk Grimm，Andrea kern et al.Novel tools for production and purification of recombinant adenoassociatedvirus vectors，Human Gene Therapy 92745-2760，1998)使rAAV的纯化过程大大简化，而且回收率有较大提高。但这些方法亦有成本高、处理大体积样品能力有限、实验条件和仪器设备要求高等缺点。
一般地，重组AAV病毒纯化过程可分为以下步骤1)细胞裂解(无细胞系统除外)最经典的方法是采用反复冻融3～4次的方法。将含有rAAV病毒的细胞及培养液收集在一起，在干冰/乙醇浴和37℃水浴中反复冻融3-4次，目的是破碎细胞以释放rAAV。这种方法的缺点是rAAV病毒释放不全。其它方法还有超声波破碎细胞法、脱氧胆酸法等。
2)辅助病毒灭活(无辅助病毒包装系统除外)利用腺病毒和单纯疱疹病毒对热敏感的特点，一般用56℃水浴30～2hr灭活辅助病毒。
3)重组AAV病毒与细胞碎片分离一般用低速离心除去细胞碎片。
4)重组AAV病毒与其它组分分离及浓缩最常采用的方法是氯化铯密度梯度超速离心法。其分离依据是成熟的AAV病毒颗粒的浮力密度为1.40～1.42g/cm3。最近，等用抗AAV病毒颗粒的单克隆抗体制成亲和层析柱，用来分离rAAV获得很好的纯化和浓缩效果。
5)纯化的重组AAV的纯度和滴度检测纯度的主要检测方法有HPLC、SDS-PAGE电泳、紫外分光光度分析、电镜分析等。滴度测定包括物理滴度(particles/ml)和感染滴度(TU/ml)的测定。
本发明提出了一种分离纯化rAAV病毒的新方法，其特点是简便快速、纯化效果好、rAAV病毒的回收率高、成本低且易于放大至工业化生产规模。本发明提出的rAAV病毒分离纯化方法主要由以下步骤组成1)rAAV的大量产生用HSV1-rc为辅助病毒感染含有目的基因的AAV载体细胞株，待细胞出现完全CPE变化并漂浮起来时(约48～72hr)，收获细胞培养物(细胞及培养液)作为粗制裂解液，测量其体积；
2)辅助病毒灭活及细胞裂解用氯仿处理原料液可达到灭活辅助病毒HSV1-rc和裂解细胞的双重目的，但对AAV病毒没有影响。有感染性的单纯疱疹病毒颗粒有双层脂质外膜及镶嵌在其中多种病毒糖蛋白，该层被膜是HSV病毒感染细胞所必需的。氯仿可以溶解脂质，并使大量蛋白变性。用氯仿处理可100％灭活HSV病毒，同时可以高效裂解细胞膜和核膜。AAV病毒颗粒具有氯仿抗性，用氯仿处理对其结构和感染活性没有影响。
3)细胞碎片和变性蛋白的去除在细胞裂解液中加固体氯化钠至终浓度1.0～1.2mol/L，搅拌溶解。11000g离心10～15min。将上清移入一干净三角烧瓶中瓶中，估算其体积。弃去离心的沉淀和下层氯仿。加氯化钠可促使AAV病毒颗粒与细胞碎片分离，也是下一步用聚乙二醇沉淀AAV病毒所必需。
4)在上清中加入固体聚乙二醇8000至终浓度6～12％，搅拌溶解。4℃放置1小时以上至过夜。12000g离心10～15min。将上清倾入另一干净烧瓶中，尽量让上清流尽。沉淀用适量的PBS2+溶解，加DnaseI和RNase消化AAV病毒颗粒之外的残余DNA和RNA。加等体积的氯仿抽提，12000g离心5min，在无菌操作下小心吸出上层水相，移入无菌管中。该液体即为浓缩和纯化的rAAV病毒液。
本发明提出的rAAV纯化方法获得的rAAV病毒纯度可达到＞99％。从2×109cells(5只110×288mm转瓶)粗制裂解液中制备的rAAV滴度可达到1014-15particles/ml，感染滴度可达＞1012-13TU/ml。rAAV的回收率＞90％。获得的rAAV可用于体外实验和动物实验，进一步纯化后可获得临床级的AAV产品。
该病毒液进一步纯化可采用双液相萃取方法。用PEG/盐系统或PEG/Dex系统。最终用透析去除PEG和盐，用超滤除菌。
进一步纯化亦可采用柱层析(包括分子筛层析、亲和层析)或氯化铯超速离心，及透析和超滤等方法。
本发明提出的rAAV纯化方法尤其适合于用单纯疱疹病毒为辅助病毒产生的rAAV的纯化，亦适合于用无辅助病毒生产系统及体外包装系统获得的rAAV的纯化。
实施例1用转瓶生产rAAV-GFP病毒将报告基因GFP插入通用型AAV载体pSNAV-1中，构建成重组AAV载体pSNAV-1/GFP。将pSNAV-1/GFP用Lipofectamine(GIBCO BRL)转染试剂导入BHK-21细胞(购自ATCC，用含10％FBS的RPMI1640培养液37％培养)中，加G418 800μg/ml选择培养10～15d。获得混合细胞克隆的载体细胞。将该载体细胞扩大培养至4只35cm2的方形玻璃培养瓶中，长满(约有8×107个细胞)后用胰酶消化，接种到1只转瓶(110×288mm)中，37℃低速转动(1转/分钟)培养。培养液体积为200ml/转瓶。3d后将该转瓶中的细胞用胰酶消化传入5只转瓶中扩大培养。待细胞长满后(约有2×109个细胞)，将培养液倾出，加辅助病毒HSV-rc/ΔUL2(在HSV1病毒基因组的UL2基因的XbaI位点中插入AAV repcap基因，中国专利申请号 98120033.8)5～10ml(MOI＝0.5～2)，低速转动(1转/分钟)吸附病毒1～2hr。加200ml/转瓶无血清1640培养液37℃低速转动(1转/分钟)培养。待细胞完全病变、容易脱落时，盖紧瓶盖剧烈振摇，将瓶壁上的细胞全部洗脱至培养液中。收集合并5转瓶的培养物，估算其体积，分装至500-ml三角烧瓶中，250ml/瓶。用于下一步纯化。实施例2用本发明提出的纯化方法纯化rAAV接实施例1。在每一只三角瓶中加入氯仿25ml(10∶1 v/v)，置于37℃摇床中剧烈振摇1～1.5hr。取出在室温下静置10min。加DNase和RNase至终浓度1μg/ml。轻轻混匀，室温下消化30～60min。加入固体氯化钠至终浓度1mol/L，振摇溶解。4℃ 12000rpm离心15min。取出上层水相，弃去氯仿和沉淀。加PEG8000至终浓度10％ (w/v)。振摇溶解。4℃放置过夜。4℃ 11000rpm/min离心15min。将上清倒入干净容器中。将离心管倒扣在吸水纸上，让上清尽量流尽。用5ml PBS2+缓冲液将各离心管管底和管壁上的沉淀吹打洗脱下来合并，将其分装至1.5-ml塑料离心管中(0.6ml/管)，加等体积的氯仿抽提。4℃12000g离心5min，在无菌操作下小心吸出上层水相，移入无菌管中。该液体即为浓缩和纯化的rAAV-GFP病毒液。该病毒液体积比初始体积浓缩了200倍。实施例3AAV空壳病毒颗粒的生产和纯化用转瓶培养BHK-21细胞。细胞长满后加辅助病毒HSV-rc/ΔUL2用与实施例1相同的方法获得病变细胞培养物。用本发明提出的rAAV纯化方法提取该培养物的AAV病毒。获得的病毒液进行电镜观察(附图三)，可见大量病毒颗粒，颗粒中心密度较高，表明为病毒空壳。该结果说明用辅助病毒HSV-rc/ΔUL2感染没有转染AAV载体DNA(不含ITR序列)的BHK细胞可有效地产生AAV病毒空壳颗粒。实施例4rAAV病毒滴度和纯度检测接实施例2。用地高辛标记(Boehringer Mannhein试剂盒)的GFP探针点杂交方法检测纯化的病毒液中rAAV-GFP病毒的滴度(particles/ml)。取10ul纯化的病毒液用PBS2+缓冲液稀释10倍。加DNase和RNase至终浓度1ug/ml37℃消化1hr。沸水浴5min之后置于冰浴中。用dilution buffer 10倍比系列稀释后点膜，1ul/点。120℃烤膜30min。68℃预杂交1hr。加探针68℃杂交过夜。洗膜，显色。结果第1～4点明确阳性，第5点弱阳性。假设点杂交方法检测DNA的灵敏度为106分子，计算病毒滴度＝104～5×106×10×1000＝1014～15particles/ml。用SDS-PAGE电泳法检测纯化的病毒液中AAV病毒的纯度。灌制SDS-PAGE分离胶和积层胶。分离胶浓度为10％。分别取纯化的病毒液和最后一步氯仿抽提前的病毒液20ul，加2×loading buffer 20ul。沸水浴3min。每孔加样10ul，200V电泳1hr。电泳完毕后用考马斯亮蓝R250染色液(在45ml甲醇45ml水和10ml冰醋酸中溶解0.25g考马斯亮蓝R250)染色，用相应的脱色液脱色。蛋白质分子量Markers的大小依次为97400，66200，42700，31000，14400Dal(Promega)。电泳结果见说明书附
附图说明图1。电泳结果显示，用本发明提出的纯化方法获得的纯化的rAAV病毒液电泳表现为三条带(lanel)，其大小分别与3种AAV外壳蛋白的大小相符合(野生型AAV-2外壳蛋白VP1为87kDal，VP2为72kDal，VP3为62KDal，)，占总蛋白99％以上；氯仿抽提可极为有效地去除杂蛋白，却不损失AAV病毒蛋白；经对lanel进行计算机扫描处理，求出三条蛋白带的强度比，恰好为10∶1∶1，与AAV-2病毒颗粒的VP3、VP2和VP1的比例相吻合。实施例5rAAV病毒的电镜分析将实施例2中纯化的rAAV-GFP病毒液经负染后在电镜下观察，可见大小均匀一致、清晰可辨的实心病毒颗粒。粒径约为20～24nm。见说明书附图2。实施例6rAAV-GFP感染性滴度的测定用含10％FBS的RPMI1640培养液37℃，5％ CO2培养HeLa细胞。在24孔板上接种HeLa细胞，5×105细胞/孔。培养过夜后，吸出培养液；取10ul纯化的病毒液稀释至1ml，以10倍比系列稀释，每孔加不同稀释度的病毒液0.5ml，37℃培养1hr。每孔加5型腺病毒(Ad5)50ul(MOI＝5)，及培养液0.5ml。37℃培养36hr后在倒置荧光显微镜下观察绿色荧光细胞，计数其中某孔的绿色细胞数n(10＜n＜100)。计算rAAV-GFP病毒滴度n×稀释倍数×1000/5＝n×109×200＝2n×1011TU/ml。估算rAAV-GFP的感染滴度为2×1012～13TU/ml之间。
权利要求1.本发明提出的rAAV病毒纯化方法由以下步骤组成a)用氯仿破碎细胞、灭活HSV辅助病毒及使大量细胞蛋白变性沉淀；b)用DNaseI和RNase处理细胞裂解液以降解核酸；c)加NaCl促使rAAV与细胞碎片分离，离心去除细胞碎片；d)用PEG/NaCl沉淀rAAV；e)用氯仿抽提去除杂蛋白和残余的PEG；f)透析除盐；g)用密度梯度离心法或亲和层析法进一步纯化rAAV。
2.根据权利要求1，将a、c、d、e步骤单独使用。
3.根据权利要求1，将a、c、d、e步骤与其它方法配合使用。
4.本发明提出的方法用于rAAV的大量分离和纯化制备。
5.本发明提出的方法用于AAV病毒空壳的大量分离和纯化制备。
6.用本发明制备的rAAV用于基因转移和基因治疗。
全文摘要本发明利用AAV病毒颗粒具有抗氯仿处理的特点,提出了一种用PEG/NaCl系统和氯仿快速而高效分离和纯化rAAV病毒的方法。该方法适合于大规模分离和纯化rAAV病毒和生产工艺化。尤其适用于以HSV病毒为辅助病毒产生的rAAV的纯化,也可用于无辅助病毒包装系统或无细胞体外包装系统生产的rAAV的纯化。经本发明纯化的rAAV病毒可用于基因转移和基因治疗。
文档编号C12N15/861GK1272538SQ9912372
公开日2000年11月8日 申请日期1999年11月17日 优先权日1999年11月17日
发明者吴小兵, 董小岩, 侯云德 申请人:北京东康龙病毒生物技术工程研究中心
