2.实验技术-吃灰去吧，荧光定量PCR整理

1. 基本原理

2. 常见的分析方法

3. 荧光定量PCR重要的概念

回顾

    常规PCR:是指在DNA聚合酶催化下，以母链DNA为模板以特定引物为延伸起点，利用脱氧核苷三磷酸 (dNTP)，通过变性、退火、延伸等步骤，体外复制出与母链模板DNA互补的子链DNA的过程。

    但是常规PCR其实对PCR扩增的终产物进行半定量和定性的分析，无法对起始模板准确定量，无法对扩增反应实时监测。

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荧光定量基本原理

实时荧光定量PCR ：简称qPCR (quantitativePCR)，利用荧光信号的变化实时监测PCR扩增反应中每一个循环扩增产物量的变化，通过ct值和标准曲线的关系对起始模板进行定量分析。

相比较于常规PCR，实时定量PCR技术不仅实现了对模板的定量，且具有灵敏度高、特异性和可靠性更好、自动化程度高和无污染的特点，使得荧光定量PCR逐渐取代常规PCR。

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常见的分析方法

目前主流的实时荧光定量PCR （Quantitative Real-time PCR）方法分为染料法和探针法。

2.1. 染料法

染料法以SYBR Green法为代表，SYBR Green染料游离时荧光微弱，一旦与双链DNA的小沟区域结合后，荧光大大增强，反应管中的荧光强度与反应管中双链DNA的数量成正比例关系，因此可以通过检测荧光计算反应管中产生的双链DNA（PCR产物）的量。

局限性：该方法没有特异性，非特异性扩增的产物也会被计入。

2.2 探针法

Taq-Man探针法是最经典的探针方法，设计一条与扩增产物能互补杂交的探针，在探针的5’端标记荧光基团（供体：激发荧光），在探针3’端标记淬灭基团（受体：抑制荧光）。

1. 当探针完整时，荧光基团和淬灭基团距离很近（探针长度）因荧光共振能量转移，荧光基团在入射光激发下不发出荧光。

2. PCR反应进行时，探针杂交在扩增产物上，当引物介导的延伸反应到达探针位置时，因taq酶拥有5’-3’的外切酶活性，会从5'端切割（水解）探针，从而使5’端的荧光基团和3’端的淬灭基团分离，使它们的间距超过10nm，超出荧光共振能量转移的范围，荧光基团此时在合适入射光的作用下，就能发出自身波长的荧光。

3. 探针杂交是特异性的，所以荧光的种类和量能特异性的代表目标产物的种类和量。

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荧光定量PCR重要的几个概念

3.1荧光扩增曲线

在PCR反应过程中，每经过一个循环,PCR产物量增加.相应的荧光信号强度也跟着增加,此时收集一个荧光强度信号。经过若干个循环后，可以得到一条以循环数(cycle threshold,CT)为横坐标和荧光强度(△Rn)变化为纵坐标的“S'形荧光扩增曲线。

人为地分为基线期、指数扩增期和平台期三个阶段:

① 基线期，扩增的荧光信号被荧光背景信号所覆盖，此时荧光信号极小，我们无法判断荧光强度的变化。

② 指数扩增期，荧光信号呈指数增长，扩增产物的量与起始模板量存在线性关系。

③ 线性增长期:原料的消耗、产物的积累、酶活的损耗等导致DNA的扩增不再呈指数扩增。

④ 平台期，由于底物耗尽等因素.荧光信号不再呈指数增加。

3.2 荧光阈值

是在荧光扩增曲线指数增长期设定的一个荧光强度标准(即PCR扩增产物量的标准）。一般为PCR反应前3-15个循环荧光信号标准差的10倍。手动设置：荧光阈值可以设定在PCR扩增的指数期中后期。

3.3 基线

    是背景曲线的一段，在扩增反应的最初数个循环里荧光信号变化不大，接近一条直线。

3.4 Ct值

    阈值循环数:表示每个PCR反应管内荧光信号达到设定的荧光阈值所经历的循环数，研究表明，每个模板的C-值与该模板起始拷贝数的对数存在线性关系，起始拷贝数越多，Ct值越小。Ct.值一般取15-35太大或者太小都会导致定量的不准确。我们利用已知起始拷贝数的标准品可做出以起始拷贝数的对数为横坐标,CT值为纵坐标的一条标准曲线。只要获得未知模板的CT值,即从标准曲线上计算出该模板的起始拷贝数。

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