前言：
1994年德国国际会议定义益生菌是含活菌和 （或） 死菌， 包括其组分和产物的有益微生物制品， 经口或经由其它黏膜途径投入， 旨在改善黏膜表面微生物或酶的平衡， 或者刺激特异性或非特异性免疫机制。这个概念首先强调了它的组成， 即有益活菌 组分 代谢产物， 或有益死菌 组分 代谢产物，或有益活菌 死菌 组分 代谢产物。如今，普遍被接受的益生菌的定义为：具有生物活性，摄入适当量时可以对宿主产生有益的作用的微生物。益生菌目前已被广泛应用于饲料、食品和医药等工业领域。已被开发的益生菌主要有乳酸菌、芽孢杆菌、酵母菌、放线菌和真菌等几大类。
益生菌定义：
普遍被接受的益生菌的定义为：具有生物活性，摄入适当量时可以对宿主产生有益的作用的微生物。益生菌目前已被广泛应用于饲料、食品和医药等工业领域。已被开发的益生菌主要有乳酸菌、芽孢杆菌、酵母菌、放线菌和真菌等几大类。
图1 常见食品微生物图示举例
食品微生物的生物安全性：
我们在选择和应用益生菌时，不仅要考虑益生菌的功能特性，安全性也是必须要考虑的方面。随着益生菌在应用中不断出现的新问题及科学技术的不断发展，对益生菌的安全性认识也在发生变化，传统益生菌的安全性需要重新评价，新的菌株、菌种或菌属当被选做益生菌来使用时，我们需要通过标准的检测程序对其风险进行详细的评估，对于风险较高的菌株则不能进行运用。
图2 评价微生物是否符合 QPS标准的一般规程
为对益生菌的安全性作出客观而全面的评估，各国的研究者及相关国际组织对此有很多探索，如欧盟评价益生菌标准的规程见图1所示。 对菌株作出正确的鉴定是益生菌安全性评价的第一步，随后需要对菌株的不同特性进行测定，如菌株的病原性、代谢活性、过度的免疫作用及对抗生素的抗性等。
01
菌株鉴定
在分类学上对益生菌菌株的准确鉴定 是对益生菌安全性评价的基础， 也是益生菌安全性评价的第一步。 基于对该菌株所在菌属特性认识的基础上，可以对待评价菌株的特性作出初步的判断和预测。同名的不同菌株的生物学特性会有较大差异性， 而且其所发挥的作用或功效也是不同的， 具有属、种甚至株上面的差异性。这种差别表现在多方面， 如生长快慢、 抗逆性（抗酸、 碱、 胆盐、 热等）、 产酸特性、 产酶特性、 是否产生抗菌物质、 是否对生产性能有正效应、 是否具有免疫刺激特性以及加工和储运特性等。
常用的微生物鉴定方法有形态学特征、生理生化反应特征、生态学特征以及血清学反应、对噬菌体的敏感性、脂肪酸分析及分子鉴定。如联合国粮农组织/世 界卫生组织（FAO/WHO）建议对细菌首先要进行表型试验，随后利用 DNA/DNA 杂交，16S rDNA 序列测定及其它可靠方法进行遗传学鉴定，使用 DNA 脉冲场梯度凝胶电泳对菌株进行鉴定并作为黄金标准方法。
02
病原性和感染性
双歧杆菌、 乳酸杆菌一直被认为是安全的，关于其有害的报道很少，然而近期研究表明当机体处于易感状态时，乳酸菌和双歧杆菌可能会成为条件致病菌与菌血症、心内膜炎、尿道感染等疾病相关，因此人们对益生菌安全性的认识也在发生变化。同时，近年来频繁从临床感染组织中分离出乳酸杆菌、 明串珠菌、 片球菌、 肠球菌和双歧杆菌等益生菌株的事实已经引起了对这些菌株安全性以及是否具有感染性的争论, 使人们对益生菌的应用前景充满了疑问。
益生菌感染潜力举例见下表：
益生菌
感染潜力
乳酸杆菌属
（Lactobacillus）
主要为非致病菌，有些分离株为机会感染
乳球菌属
（Lactococcus）
主要为非致病菌
明串珠菌属
（Leuconostoc）
主要为非致病菌，有些分离株有感染性
链球菌属
（Streptococcus）
口服链球菌主要为非致病菌（包括嗜热链球菌），有些分离株可能引起机会感染。
肠球菌属
（Enterococcus）
有些菌株为机会致病菌，具有溶血性和抗生素抗性
双歧杆菌属
（Bifidobacterium）
主要为非致病菌，有些分离株引起人的感染
酵母菌属
（Saccharomyces）
主要为非致病菌，有些分离株引起人的感染
03
益生菌的代谢和酶对机体的影响
益生菌菌株的安全性研究， 还需要对其含有致病基因的潜在可能性以及毒性代谢产物的产生予以重视。毒力因子的检测主要通过检测参与毒力因子形成的相关毒力基因。如欧洲食品安全局（EFSA） 在2012 年颁布的关于屎肠球菌的安全性评价的指南文件中要求必须检测IS16、esp和hylefm基因。毒性代谢产物包括菌株产生的酶、溶血素、溶细胞素、肠毒素和 D-乳酸等。
主要代谢物对宿主的不利影响见下表：
代谢活动或代谢产物
不利影响
D-乳酸酸
D-乳酸酸中毒
溶血素
溶解宿主血细胞
硝基还原酶
在肠道中催化产生 致癌物质或者其他肠内毒素
氨基脱羧酶
将游离的氨基酸转化为生物胺类物质而引起食物中毒症状
糖苷酶
影响多种毒素和二 级代谢产物的生 物活性
胆盐代谢
影响脂肪的消化和吸收
黏膜脱落活性
破坏肠黏膜引起感染
毒力因子
与生物膜形成相关及部分感染相关
血小板凝集
是促进感染心内膜炎的因素
近年来，随着分子生物学的发展，特别是新一代测序技术的出现，基因组DNA测序成本迅速下降，测序速度快速提高，在条件允许的情况下，可以对一些优秀菌株进行全基因组测序， 通过生物信息学和功能基因组学进一步分析、预测所选菌株的潜在的毒力因子及有害代谢产物。
04
益生菌抗生素抗性
对菌株抗生素耐药性的测定， 是对现有的和潜在的益生菌菌株体外安全性评估的一个重要内容。 在临床上，益生菌株对某种抗生素具有抗性通常与感染相关，然而益生菌的耐药性对于服用某些抗生素而导致的菌体黏附力降低和肠道菌群失衡具有正面的调节作用。 益生菌基因组中含有抗生素抗性基因本身并非安全问题， 只要该基因没有转移给其它菌株的可能性。 而理论上含有抗生素抗性基因的益生菌可能成为潜在致病菌抗生素抗性基因的来源。 同时由于已有研究证实抗性基因可能在食品和肠道环境中发生转移， 因此检验益生菌是否含有抗生素抗性基因并区分是固有抗性还是获得性抗性是十分必要的。
对于益生菌若属于固有抗性则可以被使用， 若是获得抗性， 还需要检测抗性是通过基因突变还是获得外源抗性基因来实现， 若是基因突变则一般可以被使用，若是获得外源抗性基因则不能被使用。目前为止，已有大量报道指出乳酸菌含有抗生素抗性。
三种益生菌需测试抗性见下表：
菌株
抗生素抗性
乳球菌
磺胺嘧啶，丁胺卡那霉素，氨比西林，头孢菌素 I，氯霉素，红霉素，庆大霉素，亚胺培南，青霉素，磺酰胺，四环素，甲氧苄啶，万古霉素，青霉素，链霉素
乳杆菌
制霉菌素，萘啶酸，新霉素，多粘菌素 B，甲氧苄啶，多粘菌素，磺酰胺，链霉素，杆菌肽，头孢西丁呋喃妥因， 卡那霉素， 庆大霉素，甲硝唑，诺氟沙星，链霉素，磺胺嘧啶，替考拉宁，甲氧苄啶，万古霉素
双歧杆菌
青霉素，先锋霉素，杆菌肽，氯霉素，红霉素，克林霉素，呋喃妥因，四环素
05
益生菌的免疫效应
益生菌的一个重要的益生作用是免疫刺激，能够激发宿主对病原菌的抵抗。然而如果益生菌能在免疫缺陷宿主内导致有害的炎症或自体免疫性并引起超敏个体的超敏反应，那免疫刺激对宿主是有害的。对于免疫缺陷的病人， 可抵抗抗生素的益生菌对免疫缺陷宿主会产生危害。 益生菌可能通过分泌酶分解抗生素， 或将抗生素抗性基因转移给其它细菌。
完
文/云淡风轻
本文作者常出没于《发酵工程》工程菌群/《发酵工程》大工艺6群，作者精通自分子/小试/放大/发酵等各环节，熟知酵母/细菌/放线菌/真菌等多种类型发酵工艺
同时感谢泗水之锋（《发酵工程》食品群大牛）和山东helai王博士（《发酵工程》食品群/《发酵工程》农牧海洋群大牛）以及南京某单位发酵工程师等提供的宝贵建议。
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