（一）四逆汤抗线粒体氧化损伤
线粒体是细胞内一种重要的细胞器，通过氧化磷酸化为细胞生命活动提供能量，生物体内90％以上的ATP是由线粒体产生的，因此线粒体又被称为细胞氧化供能的“动力工厂”。在多种类型心衰的发病过程中，均出现能量代谢的障碍，表现为心肌高能磷酸化合物特别是磷酸肌酸（CrP）含量的降低。线粒体本身以及线粒体产生能量的过程很容易受到各种复杂因素的影响，其中氧自由基介导的线粒体损伤最为突出，可能与心衰时能量代谢障碍有关。在正常生理条件下，线粒体产生一定量的活性氧（reactive oygen species，ROS）以满足呼吸链的反应合成ATP，供应心肌细胞以完成正常的生命活动。然而异常增多的氧自由基就会对线粒体以及细胞产生氧化损伤。而且线粒体功能的异常又可能进一步促进ROS的产生，从而导致细胞遭受氧化损伤的机会加大，出现心肌纤维化，胶原沉积，心肌重构等等，加速心力衰竭的进程。自由基的产生增多在阿霉素性心脏毒性的发生机制中占有重要作用。由于自由基的增多，会导致脂质过氧化反应增强，损伤线粒体膜，导致钙超载，能量代谢障碍，从而严重影响心肌的收缩及舒张功能。氧化应激是机体内氧自由基产生超过其清除的代谢失衡病理状态，是使心衰发展恶化的重要机制之一。
生理条件下，线粒体内也存在有效的抗氧化机制，Mn SOD是线粒体内特异清除自由基的抗氧化酶，大多数羟自由基可被线粒体膜两侧CU－Zn SOD和Mn SOD通过谷胱甘肽过氧化物酶（glutathione peroxidase,GSHPx)转化成水。因此，线粒体基质内Mn SOD的含量直接决定了线粒体清除其自身产生的自由基的能力。实验研究发现，与对照组相比，心力衰竭模型组线粒体内Mn SOD的活性明显下降，而MDA含量明显增多，表明线粒体内有明显的氧化损伤。相关性分析表明，随着Mn S0D 活性的障低，心功能逐渐下降，二者呈负相关；而且，随着MDA含量的增多，心功能逐渐下降，二者呈正相关，说明氧化应激与心力衰竭的发生密切相关。四逆汤可明显提高心衰时心肌细胞线粒体内SOD的活性，并降低MDA的含量，减少线粒体氧化损伤。MDA是一种脂质过氧化反应的标志物。氧自由基作用于心肌细胞的不饱和脂肪酸，发生过氧化脂质损伤，脂质过氧化反应的主要产物就是MDA，具有细胞毒性的MDA会造成膜的损伤，使心肌细胞膜、线粒体膜的完整性遭到破坏，膜的液态性、流动性及通透性异常，膜容量调节及离子转运动功能障碍。线粒体内膜是最靠近线粒体产生O2的部位，因此最容易引起过氧化损伤。而线粒体内外膜的通透性差别最大，外膜允许电解质、水、蔗糖及小于10kD的分子自由通过，相反，内膜在正常情况下仅允许不带电荷的小分子通过，如水、氧、二氧化碳、尿素及甘油等，故外源性的抗氧化物质不易进入线粒体。所以当氧自由基分子增多时，线粒体的膜系统可受到损害，从而影响跨越线粒体膜的质子梯度，使线粒体合成ATP的功能发生障碍。同时，线粒体的功能障碍又可导致自由基产生增多，过多的氧自由基不能被及时清除，又可引起生物膜结构蛋白质和脂质过氧化，损害线粒体膜的通透性，引起电子传递链活性的进一步下降，形成恶性循环。由于线粒体膜的存在，外源性抗氧化物质无法对线粒体内氧自由基产生清除作用，因此只有提高线粒体自身抗氧化物霉Mn S0D的活性，消除线粒体内氧化产物才能防止线粒体氧化损伤及进一步的恶性循环。四逆汤可阻断线粒体内自由基的产生，提高线粒体内Mn SOD的活性，清除线粒体内活性氧自由基，起到抗线粒体氧化损伤，保护线粒体的作用。同时，我们通过观察了线粒体肿胀程度，反映线粒体膜通透性的变化，发现四逆汤亦可明显减轻线粒体肿胀程度，维持线粒体膜正常的通透性。因此，四逆汤通过抵抗线粒体的氧化损伤，而防治了整个心肌组织发生氧化损伤，保护线粒体膜稳定性，起到了保护整个心肌的作用。既往的研究也表明，应用外源性抗氧化剂维生素E，维生素C可提高心力衰竭患者血中抗氧化物酶的水平，改变心衰的临床进程，间接证明了氧化应激与心衰的密切关系，同时也说明应用外源性抗氧自由基的药物对心衰的治疗是有益的。
（二）四逆汤对线粒体ATP酶的保护作用
线粒体是一种膜性细胞器，是亚细胞呼吸单位，为细胞内糖、脂类及氨基酸被分子氧化的场所，其重要的生物学功能是参与氧化代谢和钙代谢，生物氧化过程中释放出的能量转变为ATP分子中的末端高能健以供生理之需，这直接关系到心肌收缩的能源和张力。线粒体功能的正常依赖于其结构的完整性，其氧化磷酸化功能与其钙平衡状态密切相关。线检体主要由蛋白和磷脂组成，磷脂参与各种膜蛋白的组成，也是膜上各种酶（如Na*－K* ATP 酶、Ca2*－ATP酶、Ca2+－Mg2+ ATP 酶等）起催化反应不可缺少的物质。
Ca2*－ATP酶是膜结合酶，紧密地嵌在脂质双层结构中；Na+－K+ ATP酶镶嵌于线粒体的内膜，是保证线粒体结构和功能的重要离子泵，研究发现，线粒体膜结构损伤的减轻，膜流动性的增加可能和该酶的活性提高有关。本实验中，心衰核型组线粒体Na+－K+ ATP酶活力明显下降，这可能是由于线粒体的肿胀，造成线粒体功能异常，不能有效地进行氧化磷酸化反应，ATP生成减少，致使 ATP酶活性下降。而Na+－K+ ATP酶活力的降低，又可能导致线粒体内的Na+浓度增高，细胞内水分进人线粒体加重其肿胀程度。相关性分析亦表明Na+－K+ ATP酶活力的下降与线粒体肿胀程度呈负相关。线粒体作为参与调节细胞内Ca2*平衡的重要细胞器，生理情况下可通过其膜上的Ca2*－ ATP酶主动地将Ca2*从胞浆摄入线粒体基质内，从而在一定范围内缓冲胞浆Ca2*浓度。线粒体膜Ca2+－ATP酶是调节和维持细胞和线粒体钙稳态的关键因素，其活性一方面直接受细胞内ATP含量的影响，另一方面则依赖于膜磷脂数量和膜脂质的构造。心衰时，由于心肌ATP缺乏，自由基产生增加，脂质过氧化反应增强，损伤线粒体膜，导致膜的流动性和调节功能障碍，可能改变膜上蛋白质的功能及酶的活性。本实验发现，心衰模型组大鼠心肌细胞线粒体的Ca2*－ ATP酶活性明显下降，使线粒体调节细胞内离子平衡的能力，特别是对胞浆内Ca2*重摄取能力随之降低，细胞内游离Ca2*水平增高，严重时导致Ca2*超负荷。Ca2*转运功能的低下和超载可引起细胞不可逆损伤。线粒体内Ca2*过多可激活磷脂酶，促进膜磷脂的降解，促使线粒体膜进一步受损，而膜损伤的加重，又会抑制氧化磷酸化、ATP生成减少，加重Ca2*泵的能量供应不足，Ca2+－ATP酶活性进一步下降，从而形成恶性循环，线粒体严重受损，引起能量代谢障碍。应用四逆汤进行治疗后，对于阿霉素造成的线粒体完整性的破坏、Na+－K+ ATP酶和Ca2*－ ATP酶活性的降低具有保护作用，可明显减轻线粒体的肿胀程度。因此，四逆汤可能通过保护线粒体的功能，维持细胞内的钙稳态，保证能量供应等方面，使心肌细胞的线粒体在一定程度上避免受到阿霉素所致的氧化应激的损害，达到保护心肌细胞的作用。维持线粒体结构和功能的完整性可能是其防治阿霉素性心肌毒性的重要机制之一。
（三）超氧化物歧化酶（SOD）与心力衰竭
生理条件下，机体内存在抗氧化机制，其中最重要的就是超氧化物歧化酶。超氧化物歧化酶（superoxide dismutaes,SOD）是一种含铜、锌、铁和锰的金属酶，广泛存在于生物界。
它的作用底物是超氧阴离子（O2），能预防或治疗由超氧阴离子引起的多种疾病，是一种很有价值的药用酶。1938年Mann 和Keilinl首次从牛红细胞中分离出一种蓝色的含铜蛋白——血红蛋白（hemocuprein），1969年，Mccord和Fridovichl因其能使超氧阴离子发生歧化反应，将其更名为超氧化物歧化酶，自此，已发现了三种类型的S0D。其中，Cu－Zn S0D（copper/zinc SOD）主要存在于真核生物的细胞质中；Fe SOD（Ferrum SoD）主要存在于原核生物和少数植物中；Mn SOD（manganese SOD)主要存在于原核生物和真核生物的线粒体中。近年来，还在哺乳动物的细胞外液中发现了一种具有SOD活性的因子，主要存在于细胞外，如脑脊液、脑血管中，简称Ec SOD（excracelluiar SOD）即胞外SOD。这些SOD都对清除O2起着重要作用。这几种SOD亚型均可以歧化超氧阴离子生成过氧化氢，继而被过氧化物酶（peroxi－somal)、过氧化氢酶（catalase）或GSHPx转化成无毒的H2O和O2。因此，在生物体内维持一定水平的SOD是相当重要的。
研究表明，氧自由基参与了心力衰竭的病理过程，心力衰竭患者的氧自由基及脂质过氧化物生成过多而SOD活性明显下降，阿霉素性心力衰竭大鼠的血液、心肌组织SOD活性、线粒体SOD活性，以及Cu－Zn SOD和Mn SOD mRNA基因表达均明显降低，而且心衰越严重，Cu－Zn SOD和Mn SOD的活性也越低，提示动物机体内的抗氧化酶系统功能被削弱，清除氧自由基的能力下降，造成氧自由基的蓄积，致使细胞脂质过氧化损伤增强，而且脂质过氧化可能是从基因水平影响了蛋白酶的活力，从而影响心肌细胞功能，促使或加重了心力衰竭的发生和发展。另外，由于线粒体的Ca2+－ATP酶活性降低，造成线粒体钙超载，也可能导致Mn SOD的减少，降低线粒体对氧自由基的清除能力，进而加重自由基损伤。四逆汤的应用，在一定程度上提高了Cu－Zn SOD和Mn SOD mRNA基因表达，并且提高了阿霉素性心衰大鼠的血液、心肌组织SOD活性、线粒体SOD活性。结合四逆汤可以减少心衰大鼠的血液、心肌组织和线粒体MDA含量的结果，提示它们可能是从减少氧化损伤和增强抗氧化能力两方面来保护心肌的，为临床应用阿霉素后的心肌保护性辅助用药提供了新的治疗策略。
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