我们上一期的东盛小讲堂(直达链接)给各位同学介绍了PCR实验中会遇到的一些问题,很多同学表示有所帮助,同时也提出了另外的问题,所以呢,今天小编就集中给大家解答一下~
1克隆PCR产物的最优条件是什么?
2 PCR产物是否需要用凝胶纯化?
3 如果没有回收到目的片段,还需要作什么对照实验?
5 为什么对照实验结果好,却没有回收到目的片段?
A)连接用室温保温1小时,能满足大多数克隆,为提高效率,需4℃过夜。
B)插入片段带有污染,使3`-T缺失,或抑制连接,抑制转化。为此,将插入片段和pGEM-T正对照混合,再连接。如降低了对照的菌落数,插入片段需纯化,或重新制备。如产生大量的蓝斑,插入片段污染有核酸酶,使pGEM-T或pGEM-T Easy载体3`-T缺失。
C)插入片段不适于连接。用凝胶纯化的插入片段,因受UV过度照射,时有发生。UV过度照射会产生嘧啶二聚体,不利于连接,DNA必需重新纯化。
D)带有修复功能的耐热DNA聚合酶的扩增产物末端无A,后者是pGEM-T或pGEM-T Easy载体克隆所需。加Taq DNA聚合酶和核苷酸可在末端加A。详情查pGEM-T pGEM-T Easy载体技术资料。
E)高度重复序列可能会不稳定,在扩增中产生缺失和重排,如发现插入片段高频率地产生缺失和重排,需用重组缺陷大肠杆菌菌株,如SURE细胞
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P2102/5ml | 1800 | 720 | |
P2103/10ml | 3450 | 1380 | |
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