乳腺癌多基因检测共识与争议
刘荫华，辛 灵，赵婧祎
中国实用外科杂志,2018,38(1):79-82
2017年7月，《临床肿瘤杂志》（JCO）刊登美国临床肿瘤学会（ASCO）多基因检测临床指南更新内容。提高了MammaPrint®系统在临床应用的推荐强度。2018-01-01，美国癌症联合委员会（AJCC）第8版癌症分期系统将在全球启用。其中，首次提出针对乳腺癌采用Oncotype Dx®多基因检测的适应证推荐，受到临床广泛关注。近年来，针对早期乳腺癌的多基因检测系统不断成熟并陆续面世，不同的临床实践指南已经态度明确的推荐多基因检测用于早期乳腺癌病人复发风险预测，旨在科学指导临床医生合理的制定治疗决策，避免过度医疗。但是，目前国内有关多基因检测的研究较少。现有进行基因检测的实验室仿照国外标准所开展的乳腺癌多基因检测技术有待验证，相应的行业标准与共识有待规范。大规模推广多基因检测并指导临床实践缺乏坚实的基础，尚须谨言慎行。
基金项目：首都医学发展科研基金资助项目（No.2009-1011）；首都临床特色应用研究资助项目（No.Z131107002213007）；2016年北京大学第一医院院内基金
作者单位：北京大学第一医院乳腺疾病中心，北京100034
通信作者：辛灵，E-mail：kfs_xl@126.com
2017年美国临床肿瘤学会（American Society of Clinical Oncology，ASCO）多基因检测临床指南更新，提高了MammaPrint®临床应用的推荐强度［1］。2018年1月启动使用的美国癌症联合委员会（American Joint Committee on Cancer，AJCC）第8版癌症分期系统也首次针对乳腺癌作出Oncotype Dx®多基因检测的适应证推荐［2］。我国现阶段包括二代测序技术在内的各种基因检测所需要的人员条件和硬件技术设备已经具备，但是，除原始研发实验室以外，具有专利的多基因检测系统，尤其是重要的生物学信息分析技术细节并未对我国的任何检测机构作出授权。因此，开展独立知识产权的多基因检测研发应成为我国肿瘤相关研究的重点。推荐乳腺癌适应证人群进行多基因检测宏观已获共识，细节尚存争议。多基因检测作为成熟的临床检测项目加以推广尚须谨言慎行。
1.1 Oncotype Dx®多基因检测研究回顾 2004年Genomic Heath公司启动Oncotype Dx®多基因检测系统研究，旨在探索该系统对乳腺癌病人接受内分泌治疗长期生存的预测价值。研究采用3张10 μm乳腺癌组织石蜡切片提取RNA并制备10~50 ng/μL的RNA样品，应用Applied Biosystems Prism 7900HT TaqManPCR仪进行定量RT-PCR（TaqMan法）检测［3-4］。依据文献、实验数据、基因数据库信息综合筛选出250个相关基因，并针对NSABP-B20等3项临床试验，总计447例的乳腺癌样本为目标人群进行检测［5-7］。最终，研究根据250个基因的表达强度以及在上述3项临床试验中引物和探针的一致性，选择出16个目标基因和5个内参基因，组成包括21个基因的Oncotype Dx®多基因检测系统。其中，内参基因（ACTB、GAPDH、GUS、RPLPO和TFRC）用于标准化目标检测基因表达水平；目标基因则包括增殖相关基因、侵袭相关基因、人表皮生长因子受体-2（HER-2）相关基因、激素相关基因等信息（表1）。在此基础上，研究者通过分析21个基因表达程度，建立了分值 0～100的复发风险评分标准（recurrence score，RS）和计算公式。并结合NSABP B-20试验入组病人研究RS评分与10年复发风险之间关系，将乳腺癌分为低复发风险组（RS＜18）、中复发风险组（RS为18～31）和高度复发风险组（RS≥31）3个阈值范围。随后，以NSABP B-14试验入组病人为对象加以验证，获得高复发风险组10年远处转移风险是低复发风险组4倍的结论（30.5% vs. 6.8%），确定了Oncotype Dx®多基因检测系统的参数评价标准［4］。研究期间，Oncotype Dx®系统建立了严格的检测过程质量控制标准，以保证生物学信息及数据分析过程的科学性。
1.2 TAILORx试验与AJCC指南推荐 2006年4月，美国国家癌症研究所（National Cancer Institute）资助开展了TAILORx（Trial Assigning Individualized Options for Treatment）临床试验，旨在将基因检测用于指导临床决策，减少过度化疗。截至2010年10月共10 723例乳腺癌病人入组，入组标准包括：激素受体（hormone receptor，HR）阳性、HER-2阴性、淋巴结阴性，原发肿瘤T1c-T2，或T1b合并中、高组织学分级或核分级的原发性乳腺癌。病人均接受Oncotype Dx®检测，并根据RS评分进行分组，研究预后与RS评分的关系（图1）。2015年，试验RS＜11组单臂结果在New England Journal of Medicine发表［8］。中位随访时间69个月，5年无浸润疾病生存（invasive disease-free survival，IDFS）93.8%（95%CI 92.4%～94.9%），无远处复发生存（distant disease free survival，DDFS）99.3%（95%CI 98.7%～99.6%），无复发存活率（recurrence free survival，RFS）为98.7%（95%CI 97.9%～99.2%），总存活率（overall survival，OS）为98%（95%CI 97.1%～98.6%）。说明HR阳性、HER-2阴性的cT1-2N0乳腺癌病人，如Oncotype Dx®检测RS＜11，单纯内分泌治疗足以达到5年乳腺癌疾病控制，并避免不必要的化疗。
因TAILORx试验低复发风险评分（RS＜11）组病人获得良好预后，第8版AJCC乳腺癌分期系统以1类证据推荐临床适应证病人进行Oncotype Dx®多基因检测。并推荐作为乳腺癌预后分期参考信息用于指导临床决策。
2.1 MammaPrint®多基因检测系统回顾 Mammaprint®检测系统由荷兰癌症研究所（The Netherlands Cancer Institute）与美国罗塞特制药公司（Rosetta Inpharmatics）于2002年联合研发，用于预测早期乳腺癌预后的多基因检测系统［9］。研究共针对78例年龄＜55岁、无淋巴结转移的早期乳腺癌肿瘤样本和随访资料进行分析，入组病人中44例5年无事件生存，其余34例5年内出现远处转移。研究利用快速冰冻肿瘤组织制备互补RNA（complementary RNA，cRNA），应用寡核苷酸Hu25K基因芯片（Agilent公司）检测24479个目标基因和1281个参考基因。筛选至少在5个样本中肿瘤组织与正常组织表达差异在2倍以上（P＜0.01）基因，获得5000个符合条件基因。随后，计算基因与疾病预后的相关系数，以相关系数＜-0.3和＞0.3为阈值，获得与疾病预后高相关性的231个基因，并依据相关性强弱顺序排列。通过“留一法”和交叉验证得到疾病预测能力最高的70个基因组合，70个基因中分别包含了与细胞增殖、侵袭、转移和血管生成相关基因。最终，为了降低基因组合对高危病人的风险低估，人为规定高危风险错判率应＜10%，研究者调整阈值并确定了目前应用的Mammaprint®多基因检测系统。
2.2 MINDACT试验与ASCO推荐 2007年，欧洲癌症研究与治疗联盟（European Organization for Research and Treatment of Cancer，EORTC）批准MINDACT临床试验（Microarray in node-negative and 1 to 3 Positive Lymph Node Disease May Avoid Chemotherapy，MINDACT）。该项Ⅲ期临床试
验［10］于2007-2011年纳入来自9个国家、112个医疗机构6693例淋巴结0~3枚转移的早期浸润性乳腺癌病人。全部病人接受Adjuvant！Online和MammaPrint®检测评估临床风险和基因风险。对低临床风险 低基因风险组的2745例（41.0%）病人不进行辅助化疗，对高临床风险 高基因风险组的1806例（27.0%）病人进行辅助化疗。而对临床风险与基因风险评价不一的病人，包括低临床风险 高基因风险组的592例（8.8%）病人和高临床风险 低基因风险组的1550例（23.2%）病人，随机分组决定是否进行辅助化疗。2016年，该研究5年随访结果发表于New England Journal of Medicine［11］。592例低临床风险 高基因组风险病人中接受化疗组5年无远处转移存活率为95.8％（95%CI 92.9%～97.6%），未接受化疗组为95.0% （95% CI，91.8%～97.0%）。提示临床低风险乳腺癌病人依据基因检测结果选择是否辅助化疗不能提供临床获益。1550例高临床风险低基因风险病人中，接受化疗组5年无远处转移发生率为95.9％（95% CI 94.0%～97.2%），未接受化疗组为94.4％ （95% CI 92.3%～95.9%）。说明高临床风险病人，基因检测判定低复发风险而不接受化疗仅降低1.5%的5年疾病控制获益，提示低基因风险病人可以免除辅助化疗。
2011年St Gallen专家共识首次将其纳入早期乳腺癌病人的临床诊治推荐［12］。2017年ASCO专家组以高质量和高强度证据级别推荐临床适应证人群接受MammaPrint®多基因检测［1］。
3.1 乳腺癌病人多基因检测相关共识 与传统TNM分期、病理学资料相比，多基因检测系统提供了更为准确的预后预测信息，为科学选择治疗方案提供了可靠的参考依据。截至2017年，NCCN《乳腺癌临床实践指南》［13］、St Gallen乳腺癌专家共识［14］，ASCO乳腺癌指南［1］、欧洲肿瘤标记物协作组（European Group on Tumor Markers，EGTM）指南［15］分别以高级别证据推荐Oncotype Dx®及MammaPrint®进入临床实践。2017年第8版AJCC乳腺癌分期系统也以1类证据推荐Oncotype Dx®多基因检测系统对乳腺癌预后分期进行评价（表2）。目前，乳腺癌多基因检测已经作出明确适应证推荐：用于ER/PgR阳性、HER-2阴性、淋巴结阴性或有限转移（1~3枚淋巴结转移），且具有临床高风险的乳腺癌病人制定辅助化疗决策；不推荐用于三阴型、HER-2阳性型乳腺癌；不推荐用于淋巴结转移＞3枚的乳腺癌；也不推荐用于ER/PgR阳性、HER-2阴性、淋巴结阴性、临床低风险病人制定辅助化疗决策。指南推荐Oncotype Dx®检测RS＜11，或MammaPrint®检测为低风险的乳腺癌病人可以免除辅助化疗。
除Oncotype Dx®及MammaPrint®以外，EndoPredict ®、PAM 50 ®以及 Breast Cancer Index三项乳腺癌多基因检测系统也受到广泛推荐。
3.2 严谨的技术参数和判读标准是乳腺癌多基因检测的保证 目前，Oncotype Dx®和MammaPrint®二项多基因检测系统已获得美国食品药品管理局（FDA）批准和众多国际指南的临床应用推荐。一系列严格的检测技术标准、所获得生物信息合理的分析和研究结论的科学论证，奠定了多基因检测在临床的地位。回顾其研究历程，严谨的实验设计和生物学参数判读标准的制定至关重要。其中，Oncotype Dx®在初始研发期间从新鲜冰冻肿瘤组织标本到石蜡组织提取RNA的转化；注重被检测组织有效肿瘤成分，规定肿瘤组织占石蜡切片比例＜5%，提取RNA含量＜0.5 μg，或RT-PCR 循环数＞35，说明肿瘤组织或RNA含量不够，不能进行Oncotype Dx®检测［4］；必须建立内参基因用来平衡不同时间段的RNA提取质量和含量的影响等要求；保证了生物学信息及数据分析过程的科学性。而MammaPrint®检测通过对基因热图分析进行风险评价的技术标准仍然受到专利保护。二项多基因检测系统的技术细节和生物学数据分析解读保持独家专享，成为检测结果严谨、可信的重要保证。
3.3 推动我国乳腺癌多基因检测研究健康发展 2015年，New England Journal of Medicine撰文对于精准医学定义作出科学解读，认为精准医学是基于病人遗传学、生物标记物、表型特征或社会心理特征，对病人进行的个体化医疗。其目标是改善病人的临床疗效，并尽量减少不必要的副反应［16］。近10年来，乳腺癌临床医学已经超越解剖学为基础的群体治疗，稳步进入依据分子病理学诊断进行分类治疗的时代。伴随人类基因谱解码和二代测序技术的进步，肿瘤精准医学和个体化医疗理念成为新的关注热点。通过基因检测获取精准的生物学信息，科学指导肿瘤诊治的相关研究不断获得突破。在乳腺癌领域，以BRCA基因分析筛查家族性乳腺癌高危人群获得共识并在临床得到推广［17］。以Oncotype Dx®和MammaPrint®多基因检测系统为代表，针对适应证乳腺癌病人采用多基因分析，科学预测复发风险并指导个体化制定治疗方案正在受到国际指南推荐。
近年来，国内针对基因检测的技术研究和临床推广受到社会不同层面的广泛关注，最新的仪器设备和高端技术人才不断引入中国。基因研发已经成为一些城市标志性的战略发展方向。这些事实预示我国有望为人类基因工程研究作出重要贡献。同时，必须客观的认识到，我国以华裔人群为主体，具有独立知识产权和自主研发的乳腺癌多基因检测临床试验尚无报道。国内现有的基因检测机构仿照国外标准所进行的乳腺癌多基因检测技术有待验证。相应的行业标准与共识缺少规范，结果尚不可靠。在我国现阶段，单独根据多基因分析进行辅助化疗需要慎重，预测乳腺癌复发风险仍建议以临床病理学指标为基础，如果两者结果不一致，应以传统病理学指标为主，大规模推广多基因检测并指导临床实践尚缺乏坚实的基础。
（参考文献略）
（2017-11-30收稿）
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