药敏试验
测定抗菌药物在体外对病原微生物有无抑菌或杀菌作用的方法称为抗菌药物敏感性试验（Antimicrobial Susceptibility Test），简称药敏试验（AST）。
【临床意义】
预测抗菌治疗的效果；
指导抗菌药物的临床应用；
发现或提示细菌耐药机制的存在，能帮助临床医生选择合适的药物，避免产生或加重细菌的耐药；
监测细菌耐药性，分析耐药菌的变迁，掌握耐药菌感染的流行病学，以控制和预防耐药菌感染的发生和流行。
稀释法药敏试验
【原理】
以一定浓度的抗菌药物与含有被试菌株的培养基进行一系列不同倍数稀释（通常为双倍稀释），经培养后观察其最低抑菌浓度。
（一）肉汤稀释法
1、培养基
使用M-H肉汤，需氧菌、兼性厌氧菌在此培养基中生长良好
2、药物稀释
药物原液的制备和稀释遵照CLSI的指南进行
3、菌种接种
配制0.5麦氏标准菌液，用肉汤（宏量稀释法）、蒸馏水或生理盐水（微量稀释法）稀释菌液，使最终菌液浓度（每管或每孔）为5×10e5 CFU/ml
4、结果判断
读取试管内或小孔内的MIC（μg/ml）。微量稀释法时，常借助于比浊计判别是否有细菌生长。有时根据需要测定最低杀菌浓度（minimal bactericidal concentration, MBC）：把无菌生长的试管（微孔）吸取0.1ml加到冷却至50℃ M-H琼脂混合倾注平板，同时以前述的稀释1：1000（或1：200）的原接种液作倾注平板，培养48～72小时后计数菌落数，即可得到抗菌药物的最小杀菌浓度
5、质量控制
对于常见需氧菌和兼性厌氧菌，M-H琼脂，孵育时间、环境、质控菌株同纸片扩散法
（二）琼脂稀释法
琼脂稀释法是将药物混匀于琼脂培养基中，配制含不同浓度药物平板，使用多点接种器接种细菌，经孵育后观察细菌生长情况，以抑制细菌生长的琼脂平板所含药物浓度测得MIC
1、培养基
M-H琼脂为一般细菌药敏试验的最佳培养基，调整pH在7.2~7.4，pH的过高或过低会影响药物效能
2、含药琼脂制备
将已稀释的抗菌药物按1:9加入在45~50℃水浴中平衡融化M-H琼脂中，充分混和倾入平皿，琼脂厚度为3~4mm
3、细菌接种
将0.5麦氏比浊度（1.5×10e8 CFU/ml）菌液稀释10倍，以多点接种器吸取（约为1~2 ul）接种于琼脂表面
4、结果判断
将平板置于暗色、无反光表面上判断试验终点，以抑制细菌生长的药物稀释度为终点浓度。试验菌的结果报告可用MIC（g/ml）或对照CLSI标准用敏感（S）、中介（I）和耐药（R）报告。有时对于稀释法的批量试验，需要报告MIC50、MIC90。MIC50 是指抑制50％试验菌的最低药物浓度，MIC90 是指抑制90％试验菌株的最低药物浓度。
纸片扩散法药敏试验
又称K-B法，是目前各国临床微生物实验室广泛采用的标准纸片扩散法。
【原理】
将含有定量抗菌药物的纸片贴在已接种测试菌的琼脂平板上，纸片中所含的药物吸收琼脂中水分溶解后不断向纸片周围扩散形成递减的梯度浓度，在纸片周围抑菌浓度范围内测试菌的生长被抑制，从而形成无菌生长的透明圈即为抑菌圈。抑菌圈的大小反映测试菌对测定药物的敏感程度（半定量），并与该药对测试菌的MIC呈负相关。
【方法】
【影响因素】
培养基的质量：MH琼脂、pH(7.2~7.4)、深度（4mm)等。
药敏纸片的质量（直径6.35mm、吸水量20μl)药含量。
接种菌量正确与否（麦氏比浊标准的配制：625nm吸光度值为0.08~0.10）
孵育条件：温度（37℃）、时间（16h-18h)
实验操作质量、测量工具的精度
质控标准株本身的药敏特性是否合格。（金黄色葡萄球菌ATCC25923、大肠埃希菌ATCC25911、铜绿假单胞菌ATCC27853等）
E-TEST药敏试验
（一）原理
E试条是一条5mm×50mm的无孔试剂载体，一面固定有一系列预先制备的，浓度呈连续指数增长稀释抗菌药物，另一面有读数和判别的刻度；抗菌药物的梯度可覆盖有20个MIC对倍稀释浓度的宽度范围；
将E试条放在细菌接种过的琼脂平板上，经孵育过夜，围绕试条明显可见椭圆形抑菌圈，其边缘与试条交点的刻度即为抗菌药物抑制细菌的最小抑菌浓度。
（二）培养基
需氧菌和兼性厌氧菌：M-H琼脂；MRSA/MRSE：M-H琼脂+2%NaCl；肺炎链球菌：MH琼脂+5%脱纤维羊血；淋病奈瑟菌：GC+1%添加剂
（三）细菌接种
对于常见需氧菌和兼性厌氧菌，使用厚度为4mmM-H琼脂平板，用0.5麦氏标准的对数期菌液涂布，待琼脂平板完全干燥，用E试验加样器或镊子将试条放在已接种细菌的平板表面，试条全长应与琼脂平板紧密接触，试条MIC刻度面朝上，浓度最大处靠平板边缘
（四）结果判断和报告
读取椭圆环与E试验试条的交界点值，即为MIC。
球菌
主要是化脓性细菌——能感染人体并引起化脓性炎症的细菌
第一节 葡萄球菌属
分布非常广泛。病原性葡萄球菌是最常见的化脓性细菌，医务人员的带菌率70% vs 正常30%。主要包括三个菌种：金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌及腐生葡萄球菌。
一、金黄色葡萄球菌
（一）生物学特性
1、形态染色：
单个菌体呈球形，呈葡萄串状排列，直径平均1 μm，G+菌，无鞭毛，无芽孢；
2、培养特性：
营养要求不高，普通培养基即可生长，中等大小S型菌落，并因种不同出现金黄色、白色、柠檬色脂溶性色素，金萄菌溶血毒素在血平板上形成β溶血。
3、 生化反应：
触酶（+），致病菌株分解甘露糖。
4、 抗原结构
葡萄球菌A 蛋白 (SPA) 、多糖抗原（磷壁酸中的成分）、荚膜抗原
葡萄球菌A蛋白(SPA)：存在于90%以上的金黄色葡萄球菌细胞壁表面的一种蛋白质，能与人及多种哺乳动物的IgG分子的Fc段非特异性结合。功能：具有抗吞噬作用可进行协同凝集反应，以及免疫荧光、放射免疫和酶联免疫技术中用来替代第二抗体，促进细胞分裂，与噬菌体吸附呈负相关，激活补体途径。
荚膜：有利于黏附和抗吞噬。
多糖抗原（磷壁酸抗原）：黏附。
5、分类
①依生化反应不同分为： 金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、腐生性葡萄球菌
②依色素不同分为： 金黄色葡萄球菌、白色葡萄球菌、柠檬色葡萄球菌
③依是否产生凝固酶分为： +/ -
④依噬菌体裂解作用不同分为：4~5群26型
6、抵抗力：
是无芽胞菌中抵抗力最强的：干燥脓汁、痰液中存活２~３月；耐热（60℃ 1h 或80℃ 30min 才可杀灭）；耐盐（10%~15% Nacl)；对碱性染料敏感（2%~4%龙胆紫）；对磺胺和青霉素耐药（90%金葡）
（二）致病性与免疫性
【致病物质】
1、凝固酶：
是指于体外能使含有抗凝剂（枸橼酸钠或肝素）的人或兔血浆发生凝固的酶类。是鉴别葡萄球菌有无致病性的指标（但也有例外）。
结合凝固酶：结合于菌体表面，其作用是在菌体表面形成纤维蛋白原受体，当细菌混悬于人或兔血浆中时，纤维蛋白原与其受体两者交联而使细菌凝聚。
凝固酶耐热，100℃ 30min，或高压灭菌仍保持部分活性。易被蛋白酶分解破坏。
功能：阻碍吞噬细胞对细菌的吞噬及杀灭作用；纤维蛋白还可沉积在病灶周围，阻止药物及机体内杀菌物质与细菌接触，利于其繁殖。纤维蛋白的大量形成能限制细菌扩散，并易使局部毛细血管栓塞，导致组织坏死，故葡萄球菌引起的化脓感染多为局限性。
决定了金黄色葡萄球菌引起化脓性感染时的感染特点：病灶局限、不易扩散、而且脓汁粘稠。
2、葡萄球菌溶血素：
性质：属外毒素，血平板菌落周围产生β溶血环
分型：分α、β、γ、δ、ε五型，对人致病的主要有α溶血素，对白细胞、血小板和多种组织细胞有破坏作用，并能引起局部小血管收缩，导致局部组织缺血和坏死。
抗原性：强，经甲醛处理可制成类毒素，用与葡萄球菌 感染的防治和治疗。
溶血机制：α溶血素对红细胞的作用机制是毒素分子插入细胞膜疏水区，破坏膜完整性，造成细胞溶解，血红蛋白外逸。虽非葡萄球菌感染中唯一的毒力因子，但是当感染灶形成后是造成组织病变的重要致病物质。
3、杀白细胞素：
选择性地作用于中性粒细胞和巨噬细胞，使细胞破坏并在抵抗宿主细胞的吞噬作用、增强本菌侵袭力方面有一定意义。
4、肠毒素：
部分金葡菌产生，可引起急性胃肠炎。属外毒素，有多种血清型，但以A、D型引起的食物中毒多见。是热稳定的单纯蛋白，100℃ 30 min仍有活性，且不受胰蛋白酶的影响，食入后引起急性胃肠炎。作用机制不明，有超抗原特性，作用部位在中枢神经。
5、表皮剥脱毒素：又称表皮溶解毒素
性质：蛋白质，有抗原性，可被脱毒称为类毒素。类别：A型噬菌体编码耐热，B型质粒编码不耐热。作用：引起葡萄球菌烫伤样皮肤综合征（SSSS）
6、毒性休克综合征-1（TSST-1）：
引起毒性休克综合征。诱发休克的机制：抑制内毒素的脱毒或直接损伤肝枯否氏细胞，使内毒素在体内蓄积；刺激枯否氏细胞等单核吞噬细胞系统，释放血管活性物质，干扰心血管系统及血液动力学；增加毛细血管通透性，继而引起心血管功能损伤而导致休克-毒性休克综合征（TSS）
7、其它
①耐热核酸酶：致病性葡萄球菌产生，其特点是耐热，经100 ℃ 15分钟或60 ℃ 2小时不被破坏；能较强的降解DNA或RNA。临床上已将耐热核酸酶作为测定葡萄球菌有无致病性的重要指标。
②透明质酸酶：又称为扩散因子，溶解细胞间质中的透明质酸，利于细菌的扩散。90%以上的金黄色葡萄球菌产生此酶。
③脂酶 (lipase)：作用为分解血浆和机体各部位表面的脂肪和油类，细菌藉以获得必需营养从而可定居于分泌脂质的部位，故脂酶的产生对细菌入侵皮肤和皮下组织是很重要的。
【所致疾病】
1、化脓性感染：
局部性感染: 伤口感染、疖、痈、毛囊炎
全身性感染：败血症、脓毒血症
内脏器官感染：呼吸道感染、脓胸、心内膜炎
假膜性肠炎：菌群失调后引起的局部炎症
尿路感染
2、毒素性疾病：食物中毒、烫伤样皮肤综合征、中毒性休克综合征
【免疫性】
人体对葡萄球菌感染具有天然免疫力，病后机体可产生抗体，但维持时间短，可再次感染
（三）微生物学检查
1、取材：脓汁、血液、可疑食物、呕吐物、粪便等
2、直接镜检：革兰染色
3、分离培养和鉴定：形态学鉴定、抗原性测定、药敏试验
血平板上有透明溶血环，多为金黄色菌落；血浆凝固酶试验；耐热核酸酶试验；厌氧甘露醇发酵
4、肠毒素检验：动物实验、ELISA
5、金黄色葡萄球菌的鉴定依据：产生血浆凝固酶、耐热核酸酶；金黄色色素；溶血素；发酵甘露醇。
（四）防治
预防很重要，医务人员的带菌率高达70% ，是院内交叉感染的重要传染源；注意个人卫生；加强食品卫生管理；防止医院内感染；严防乱用抗生素；药敏试验指导下用药。
二、凝固酶阴性葡萄球菌 （CNS）
过去认为不致病，但目前已成为医源性感染的常见菌，而且耐药菌株为金葡更为多见。特性：正常微生物丛；菌群失调症、医源性感染
CNS十余种与致病有关，最多是表皮葡萄球菌和腐生葡萄球菌。常引起泌尿系统感染、细菌性心内膜炎、败血症及术后感染。
第二节 链球菌属（streptococcus）
营养要求高（血液、 血清、葡萄糖）；在血清肉汤中易形成长链，管底呈絮状沉淀；在血琼脂平板上, 形成灰白色，表面光滑，边缘整齐，直径0.5~0.7mm的细小菌落；不同菌株溶血性不一
一、链球菌属分类
（一）根据血平板上溶血现象分类
1、甲型溶血性链球菌：菌落外1~2mm宽草绿色不完全溶血环（α溶血），为条件致病菌（肺炎链球菌也是本种溶血）。
2、乙型溶血性链球菌：菌落外2~3mm宽透明的完全溶血环（β溶血），致病力最强。
3、丙型链球菌：不溶血，不致病。
（二）根据抗原结构的分类
细胞壁多糖抗原—C抗原分群：A、B、C等20群，对人致病的90%属A群。同一群又分若干型， 如： A群根据M型抗原分成约100型。
（三）根据氧的需要分类
需氧链球菌及兼性厌氧链球菌：致病
厌氧链球菌：条件致病菌
传统分类：A、C、G群β溶血型链球菌 / B群β溶血型链球菌：无乳链球菌 / α溶血溶血性链球菌：肺炎链球菌和草绿色链球菌 / 不溶血D群链球菌
二、抗原构造
（一）蛋白质抗原：又称表面抗原，为细胞壁中的蛋白质成分，位于多糖抗原的外侧，可分为M、R、T、S四种，与致病有关的是M蛋白，它为特异性蛋白，可用于分型。
（二）多糖抗原：又称C抗原，可用于分群或分族，除甲型链球菌外，所有链球菌细胞壁中均有此抗原，依C抗原的差异，可将链 球菌分为A、B、C等20个族，对人致病的溶血性链球菌90%属A族
（三）核蛋白抗原：P抗原, 无特异性，与葡萄球菌交叉
三、抵抗力：
不强，60℃ 30分钟可被杀死，对一般消毒剂及抗菌药敏感，其中只有粪链球菌的抵抗力较强。
四、致病性与免疫性
（一）致病物质
A群链球菌（即乙型溶血性链球菌）也称化脓性链球菌，或溶血性链球菌，是人类链球菌中致病力最强的细菌，有较强侵袭力。
1、菌体成分
脂磷壁酸 (LTA)：粘附于多种细胞表面
F蛋白：粘附于上皮细胞表面，与纤维蛋白原结合，增强抗吞噬能力
M蛋白：具有抗吞噬细胞的吞噬和杀菌作用，帮助链球菌黏附于上皮细胞进行繁殖。其产生的抗体对机体有一定的保护力。可引起超敏反应性疾病。
2、侵袭性酶类
透明质酸：可分解细胞间质的透明质酸，使细菌易于组织间扩散
链激酶：能使血液中的溶纤维蛋白酶原转化成溶纤维蛋白酶，故可溶解血块或阻止血浆凝固，有利于细菌扩散
链道酶：又称链球菌DNA酶，能分解脓汁中粘稠的DNA，使脓汁稀薄，促进细菌扩散
胶原酶(collagenase)
3、毒素
（1）链球菌溶血素：
①链球菌溶血素O（SLO）：A族产生，含-SH的蛋白质毒素，对氧敏感，（ -SH易被氧化成-S-S-，失去溶血作用）；抗原性强，刺激机体产生的抗体持续时间较长。
②链球菌溶血素S（SLS）：是小分子的糖肽，含-S-S-，对氧不敏感（血平板上菌落周围的溶血环由其溶血形成）；无抗原性。
（2）致热外毒素：由A族产生，不耐热，抗原性强，又称红斑毒素或猩红热毒素，有致 热、致死作用，是引起猩红热症状的主要毒素。
（二）所致疾病
【A群链球菌】
1、化脓性疾病：丹毒、脓皮病、淋巴组织炎、蜂窝组织炎、痈等；病灶有扩散倾向，界限不清，脓汁稀薄，带血色, 也可引起其它部位的感染。
2、中毒性疾病：猩红热
3、超敏反应性疾病：急性肾小球肾炎、风湿热
【其它链球菌】
甲型链球菌 — 细菌性心内膜炎；变异链球菌 — 龋齿；B族链球菌 — 新生儿败血症、脑膜炎，免疫力低下成人继发感染；D族链球菌 — 泌尿系统感染
（三）免疫性：
可刺激机体产生多种抗体，抗M蛋白、致热外毒素抗体；人体被感染后，可获得一定的免疫力，但链球菌型别多，可反复感染。
五、肺炎球菌
属链球菌属，学名为肺炎链球菌，寄生于上呼吸道，多数不致病，是大叶性肺炎的病原体
（一）生物学性状
G+ ，有毒株在机体内形成较厚的荚膜，人工培养后消失，具有荚膜多糖抗原，营养要求高，血平板上的菌落与甲链的相似
生化反应：菊糖发酵／胆汁溶菌／Optochin敏感试验
抵抗力：弱，56℃ 20mins，对一般消毒剂均敏感，有荚膜的菌株抗干燥能力强，无阳光直射的干痰中可存活1至2年
（二）临床特征
1、致病物质：脂磷壁酸、荚膜，另外，本菌产生的溶血素、神经氨酸酶也有一定的致病作用。
2、所致疾病：当机体抵抗力减弱时，寄生在上呼吸道的肺炎球菌可引起大叶性肺炎，肺炎后可继发胸膜炎、脓胸，也可引起中耳炎、脑膜炎和败血病等。
同型免疫力牢固，因菌型多，故可因再感染其它型菌而患病
（三）防治原则
预防：多价荚膜多糖菌苗，免疫效果较好
治疗： 大剂量青霉素或林可霉素治疗；肺炎球菌对磺胺易产生耐药性。
六、微生物学检验
（一）不同标本
脓汁：直接涂片— 局部化脓性疾病 / 分离培养 — 全身感染
血清：抗链O试验 — 超敏反应性疾病 / 血清总补体和C3含量测定
痰标本（肺炎链球菌）：直接涂片 / 血平板→菊糖发酵＋、胆汁溶菌＋、Optochin敏感试验＋，动物致病性试验
（二）病原学检验
1、取材：脓汁、穿刺液、咽拭子、血液、等
2、直接镜检：Gram stain／抗原检测
3、分离培养和鉴定：
β溶血：触酶试验（与金葡相区别）、杆菌肽敏感试验（A群）、CAMP试验（B群）、其它
α溶血：菊糖发酵／胆汁溶菌／ Optochin敏感试验（肺炎链球菌）、VP／脲酶精氨酸等（草绿色链球菌）
γ溶血：胆汁七叶苷试验（牛链球菌）
4、药敏试验
（三）血清学检验
抗“O”试验（ASO test）：链球菌侵入体内产生SLO，刺激机体产生相应抗体ASO，当两者中和后，在加入SLO 乳胶试剂，因病人血清中ASO量很多，未被中和掉的抗体与乳胶试剂反应，产生清晰凝集，为阳性；无凝集，为阴性。
原理：中和试验 / 方法：间接凝集 / 结果：效价大于400单位
意义：风湿热及其活动性的辅助诊断
七、防治原则
预防：减少传染源
治疗：积极治疗，首选青霉素
第三节 奈瑟菌属 （Neisseria）
一、脑膜炎奈瑟菌
（一）生物学性状
1、G- 双球菌， 肾形或豆形，似一堆咖啡豆，无鞭毛、芽胞，有菌毛，少数可见荚膜，常存在于中性粒细胞内
2、营养要求极高，需要X、V因子，因而常用巧克力色培养基培养；专性需氧，初次分离时须供给5%~10%的CO2 才能良好生长；培养后形成较大的无色透明露滴状的菌落
3、抵抗力弱，对干燥、冷热及紫外线敏感，对常用消毒剂及抗菌素均敏感，可产生自溶酶
（二）临床特征及其免疫
1、所致疾病：是流行性脑脊髓膜炎（流脑）的病原菌，正常人带菌率为5%~10%，发病率为50%，但由于血脑屏障的存在，出现症状的为少数。
2、致病物质：菌毛、荚膜、内毒素
3、传播途径：经飞沫传播，引起流脑。
4、临床类型：普通型、爆发型、败血症型。儿童发病率比成人要高，因血脑屏障发育不成熟。
5、免疫力：不持久
（三）病原学检查
1、取材：脑脊液、血液等
2、直接检查：Gram stain／抗原检测／PCR
3、分离培养和鉴定（巧克力色平板）：形态学鉴定、触酶试验（＋）、氧化酶试验（＋）、氧化分解糖类（＋）、其它
4、药敏试验
（四）防治原则
儿童要接种流脑荚膜多糖疫苗
发现患者及时隔离、治疗，对患者用青霉素治疗或磺胺（能达到脑脊液，疗效更好）
二、淋病奈瑟菌（gonococcus） ——淋球菌
（一）生物学特性
1、形态与脑膜炎球菌很相似，有菌毛，无芽胞，无鞭毛，新分离的菌株有荚膜。
2、培养时营养要求高，也需要巧克力色血平板，抵抗力弱，初次分离也需要5%~10% CO2。
3、具有菌毛蛋白抗原、脂寡糖抗原、外膜蛋白抗原
4、抵抗力：极弱
（二）临床特征
1、致病物质：菌毛、IgA1蛋白酶、外膜蛋白、内毒素等。
2、所致疾病：成人淋病、新生儿脓漏眼
淋病是世界上发病率最高的性传染病，人对淋球菌无自然抵抗力，普遍易感，是唯一宿主。淋球菌主要经性接触传播，男性引起尿道炎，女性则引起阴道炎、外阴炎、宫颈糜烂、子宫内膜炎、输卵管炎及盆腔腹膜炎。
3、免疫力：不持久
（三）病原学检查
1、取材：浓汁、分泌物等
2、直接检查：Gram stain／抗原检测／PCR
3、分离培养和鉴定（巧克力色平板）：
形态学鉴定、触酶试验（＋）、氧化酶试验（＋）、葡萄糖发酵（＋）、其它
4、药敏试验
（四）防治原则
预防为主，洁身自爱，加强卫生宣传。患者要彻底治疗，首选青霉素，但耐药菌株日益增多
患淋病的孕妇，分娩后对新生儿要立即用1%硝酸银滴眼，防止新生儿淋病性结膜炎（即脓漏眼）的发生
肠杆菌科
是一大群寄居于人和动物肠道中的革兰氏阴性无芽胞杆菌，常随人与动物粪便排出，广泛分布于水、土壤或腐物中。
包括致病性较强、能引起人类传染病的菌属：鼠疫耶尔森菌、伤寒沙门菌
引起人类腹泻和肠道感染的菌属（四个）：埃希菌属、志贺菌属、沙门菌属、耶尔森菌属
肠杆菌科的共同特点：
1、形态与结构：革兰氏阴性杆菌，多数有鞭毛，大多有菌毛，少数有荚膜或包膜，无芽胞。
2、培养特性：需氧或兼性厌氧菌，在普通培养基上生长良好，常用肠道选择培养基分离培养。
3、生化反应：生化反应活泼，乳糖发酵试验在初步鉴别肠道致病和非致病菌时有重要意义，生化反应与致病性成反比。
4、Ag构造：菌体（O）Ag、鞭毛（H）Ag、表面（K、Vi）Ag、粘附因子（F）Ag
菌体抗原（O）Ag：为细胞壁的LPS最外侧的重复寡糖单位，决定O抗原的特异性。
鞭毛抗原（H）Ag：蛋白质成分，不耐热，特异性强；可发生H-O变异。
荚膜（K／Vi）抗原：如大肠杆菌的K抗原；多糖抗原Vi是K抗原的特殊形式，如伤寒杆菌，能阻抑O凝集
肠道杆菌共同抗原：抗原决定簇位于LPS的核心多糖上，在细菌鉴定和分类中有一定的意义
菌毛（F）抗原：是细菌表面的黏附结构，能阻断O凝集
5、变异现象：S-R、H-O、Ag、耐药性、毒素产生、生化反应等
6、传播方式：污染的饮水及食物、经消化道传播。
7、致病性：菌毛、表面Ag、内毒素、肠毒素等，以肠道症状为主
8、抵抗力：不强，加热60℃经30分钟即死亡。
第一节 大肠杆菌（埃希菌属）
大肠杆菌（E. coli）为埃希氏菌属(Escherichia)代表菌。一般多不致病，为人和动物肠道中的常居菌，在一定条件下可引起肠道外感染。某些血清型菌株的致病性强，引起腹泻，统称病致病大肠杆菌。
非致病性大肠杆菌
生理学意义：刺激机体免疫系统；为机体提供营养成分；构成机体肠道的生物屏障；
可作为水源是否被污染的依据：
我国饮水；细菌总数≤100 个/ml，大肠菌群数 ≤3个/L;
饮料：细菌总数≤100 个/ml，大肠菌群数 ≤5个/100ml。
一、生物学性状
1、形态与染色：革兰氏阴性杆菌，大小(0.4～0.7)×(1～3)μm, 大多数菌 株有动力，有普通菌毛与性菌毛，有些菌株有多糖类包膜，无芽胞 。
2、培养特性：在血琼脂平板上，有些菌株β溶血。在SS或CB选择性培养基上形成有颜色、直径2～3mm的光滑型菌落。
3、生化反应：大部分菌株发酵乳糖产酸产气，IMViC试验为“++--” ，即为大肠菌群。
4、抗原：构造较复杂，有O、K、H、F四种抗原。表示大肠杆菌血清型的方式是按O：K：H排列，例如O111:K58:H2。
O 抗原为脂多糖， H鞭毛抗原
K抗原为荚膜脂多糖抗原。从病人新分离的大肠杆菌多有K抗原，有抗吞噬和补体杀菌作用。
F抗原至少有5种，与大肠杆菌的粘附作用有关。
5、抵抗力：该菌对热的抵抗力较其他肠道杆菌强，
55℃经60分钟或60℃加热15分钟仍有部分细菌存活。在自然界的水中可存活数周至数月，在温度较低的粪便中存活更久。胆盐、煌绿等对大肠杆菌有抑制作用。对磺胺类、链霉素、氯霉素等敏感，但易耐药，是由带有R因子的质粒转移而获得的。
二、致病性
（一）致病物质
1．定居因子（CF）：也称粘附素，即大肠杆菌的菌毛。致病大肠杆菌须先粘附于宿主肠壁，以免被肠蠕动和肠分泌液清除。定居因子具有较强的免疫原性，能刺激机体产生特异性抗体。
2、肠毒素：外毒素只有肠产毒性大肠杆菌产生：
（1）不耐热肠毒素（LT）：对热不稳定，65℃经30分钟即失活。为蛋白质，有免疫原性。由A、B两个亚单位组成。LT的免疫原性与霍乱弧菌肠毒素相似，两者的抗血清交叉中和作用。
B亚单位：与小肠粘膜上皮细胞膜表面的GM1神经节苷脂受体结合
A亚单位为毒性亚单位，A1毒性成分进入细胞与结合 cAMP，细胞主动分泌Na+、K+、碳酸和水，导致严重呕吐和腹泻。
（2）耐热肠毒素（ST）：对热稳定，100℃经20分钟仍不被破坏，免疫原性弱。ST可激活小肠上皮细胞的鸟苷酸环化酶，使胞内cGMP增加，在空肠部分改变液体的运转，使肠腔积液而引起腹泻。
ST与霍乱毒素无共同的抗原关系。
3、其他：胞壁脂多糖的类脂A具有毒性。O特异多糖有抵抗宿主防御屏障的作用。大肠杆菌的K抗原有吞噬作用。
（二）所致疾病：
1、肠道外感染：多为内源性感染，泌尿系感染为主，如尿道炎、膀胱炎、肾盂肾炎、上行性尿道感染多见于已婚妇女。也可引起腹膜炎、胆囊炎、阑尾炎等。
婴儿、年老体弱、慢性消耗性疾病、大面积烧伤患者，大肠杆菌可侵入血流，引起败血症。
早产儿，尤其是生后30天内的新生儿，易患大肠杆菌性脑膜炎。
2、肠道感染：ETEC、EPEC、EIEC、EHEC、EAEC
①肠产毒性大肠杆菌（ETEC）
引起婴幼儿和旅游者腹泻，出现轻度腹泻，也可呈严重的霍乱样症状即大量的米泔水样便。腹泻常为自限性，一般2～3天即愈。营养不良者可达数周，也可反复发作。
致病因素是LT或ST，或两者同时致病。有些菌株具有定居因子，常见者为O6：K15：H16、O25：K7：H42。鉴定ETEC主要测定大肠杆菌肠毒素，血清型有一定参考意义。
②肠致病性大肠杆菌（EPEC）:
是婴儿腹泻的主要病原菌，有高度传染性，严重者可致死；成人少见。细菌侵入肠道后，主要在小肠大量繁殖。发热、恶心、呕吐、非血性便。
切片标本中可见细菌粘附于绒毛，导致刷状缘破坏、绒毛萎缩、上皮细胞排列紊乱和功能受损，造成严重腹泻,作用与志贺氏毒素相似，具有神经毒素、细胞毒素和肠毒素性。鉴定EPEC可根据临床表现与血清型。
③肠侵袭性大肠杆菌（EIEC）：为粪—口途径感染，与菌痢的发病机理相似，临床症状也类于菌痢即里急后重，且无动力故易误诊为细菌性痢疾 。靠内毒素与定居因子致病。
④肠出血性大肠杆菌（EHEC）：即STEC/VTEC；引起散发性或暴发性出血性结肠炎，可产生志贺氏毒素样细胞毒素。EHCO的主要菌型是O157：H7，还可有O26、OⅢ等。
⑤肠集聚性大肠杆菌（EAEC）：引起婴儿持续性腹泻，脱水，偶有血便，不侵袭细胞。毒素为肠集聚耐热毒素（EAST）；另一类毒素似大肠埃希菌的α溶血素。
三、微生物学检查法
（一）细菌的分离与鉴定
1．标本：血液、脓液、脑脊液等，腹泻者取粪便。
2．分离培养与鉴定：粪便标本直接接种肠道杆菌选择性培养基(SS琼脂)。血液需先经肉汤增菌，再转种血琼脂平板。采用一系列生化反应进行鉴定。典型的大肠埃希菌的基本生化反应特征：TSIA (双糖铁)产酸/产酸，产气；CIT(枸橼酸盐)阴性、URE (脲酶)阴性、IND(吲哚)阳性。肠致病性大肠杆菌须先作血清学定型试验。必要时检定肠霉毒素。
（二）卫生细菌学检查
大肠杆菌不断随粪便排出体外，污染周围环境和水源、食品等。取样检查时，样品中大肠杆菌越多，表示样品被粪便污染越严重，也表明样品中存在肠道致病菌的可能性越大。故应对饮水、食品、饮料进行卫生细菌学检查。
1．细菌总数：检测每毫升或每克样品中所含细菌数，采用倾注培养计算。我国规定的卫生标准是每毫升饮水中细菌总数不得超过100个。
2．大肠菌数指数：指每立升中大肠菌群数，采用乳糖发酵法检测。我国的卫生标准是每1000ml 饮水中不得超过3个大肠菌群；瓶装汽水、果汁等每100ml 大肠菌群不得超过5个。
四、防治原则
在肠产毒性大肠杆菌的免疫预防研究中，发现其菌毛抗原在自然感染和人工自动免疫中是一种关键性抗原。
治疗可选用庆大霉素、丁胺卡那霉素等。
第二节 志贺菌属（痢疾杆菌）
志贺氏菌属（Shigella）是一类革兰氏阴性杆菌，是人类细菌性痢疾最为常见的病原菌，通称痢疾杆菌。
一、生物学性状
1、形态与染色：大小为（0.5～0.7）×（2～3）μm，无芽胞，无荚膜，无鞭毛。多数有菌毛。革兰氏阴性杆菌。
2、培养特性：为兼性厌氧菌，能在普通培养基上生长，形成中等大小，半透明的光滑型菌落。在肠道杆菌选择性培养基上形成无色菌落。
3、生化反应：分解葡萄糖，产酸不产气。VP试验阴性，不分解尿素，不形成硫化氢，不能利用枸橼酸盐作为碳源。宋内氏志贺氏菌能迟缓发酵乳糖（37℃ 3～4天）。
4、抗原构造与分类：有K和O抗原。
K抗原在血清学分型上无意义，但可阻止O抗原与相应抗血清的凝集反应。
O抗原分为群特异性抗原和型特异性抗原，根据志贺氏菌抗原构造的不同，可分为四群48个血清型（包括亚型）
5、分类
A群：又称痢疾志贺氏菌（Sh.dysenteriae），通称志贺氏痢疾杆菌。
B群：又称福氏志贺氏菌（Sh.flexneri），通称福氏痢疾杆菌。
C群：又称鲍氏志贺氏菌（Sh.boydii），通称鲍氏痢疾杆菌。
D群：又称宋内氏志贺氏菌（Sh.sonnei），通称宋内氏痢疾杆菌。
根据志贺氏菌的菌型分布调查，我国一些主要城市在过去二、三十年中均以福氏菌为主。 其次为宋内氏菌；志贺氏菌与鲍氏菌则较少见。 但近年来，志贺氏菌Ⅰ型的细菌性痢疾已发展为世界性流行趋势。
了解菌群分布与菌型变迁情况，对制备菌苗，预防菌痢具有重大意义。
6、抵抗力：本菌对理化因素的抵抗力较其他肠道杆菌为弱。
不耐热，一般56～60 ℃经10分钟即被杀死。较耐寒，在冰块中存活96天。对化学消毒剂敏感，1%石碳酸15～30分钟死亡。
7、变异：
①S-R型变异：当菌落变异时，常伴有生化反应、抗原构造和致病性（毒到无毒）的改变。
②耐药性变异：由于广泛使抗生素，志贺氏菌的耐药菌株不断增加，给防治工作带来多困难。
③营养缺陷型变异：南斯拉夫Mel（1963年）首创的依赖链霉素的志贺氏菌株（依链株，Sd），作为口服菌苗可预防志贺氏菌痢疾。
二、致病性与免疫性
（一）致病物质
1、侵袭力：志贺氏菌的菌毛能粘附于回肠末端和结肠粘膜的上皮细胞表面，继而在侵袭蛋白作用下穿入上皮细胞内，一般在粘膜固有层繁殖形成感染灶。
2、内毒素：各型痢疾杆菌都具有强烈的内毒素。
内毒素作用于肠壁，使其通透性增高，促进内毒素吸收，引起发热，神志障碍，甚至中毒性休克等。内毒素能破坏粘膜，形成炎症、溃汤，出现典型的脓血粘液便。
内毒素还作用于肠壁植物神经系统，至肠功能紊乱、肠蠕动失调和氢挛，尤其直肠括约肌痉挛最为明显，出现腹痛、里急后重（频繁便意）等症状。
4、外毒素：志贺氏菌还可产生外毒素，称志贺氏毒素。为蛋白质，不耐热，75～80℃1小时被破坏。
该毒素具有三种生物活性：①神经毒性，作用于中枢神经系统，引起四肢麻痹、死亡；②细胞毒性，对人肝细胞、猴肾细胞和HeLa细胞均有毒性；③肠毒性，具有类似大肠杆菌、霍乱弧菌肠毒素的活性，可以解释疾病早期出现的水样腹泻。
（二）所致疾病
细菌性痢疾是最常见的肠道传染病，夏秋两季患者最多。人类对志贺氏菌易感，10～200个细菌可使10～50 %志愿者致病。传染源为病人和带菌者，粪口途径传播，潜伏期１～３天。
1、急性细菌性痢疾：发病急，常在腹痛、腹泻未出现，呈现严重的全身中毒症状。
2、慢性细菌性痢疾：急性菌痢治疗不彻底，或机体抵抗力低、营养不良或伴有其他慢性病时，易转为慢性，病程多在二个月以上。部分患者可成为带菌者，带菌者不能从事饮食业、炊事及保育工作。
3、急性中毒型菌痢：以小儿多见，在消化道症状未出现前，内毒素从肠道吸收入血，引起全身严重的中毒症状，高热、休克、昏迷、呼吸衰竭。死亡率高。
（三）免疫性
病后免疫力不牢固，机体对菌痢的免疫主要依靠肠道的局部免疫，即肠道粘膜细胞吞噬能力的增强和SlgA的作用。SIgA可阻止痢疾杆菌粘附到肠粘膜上皮细胞表面，病后三天左右即出现，但维持时间短，由于痢疾杆菌不侵入血液，故血清型抗体（lgM、lgG）不能发挥作用。
三、微生物学检查与防治
1、标本：粪便
2、分离培养与鉴定
取可疑菌落（SS/MAC上无色，透明或不透明的菌落）以生化/血清学试验鉴定到种。志贺菌的基本生化反应特征表现为：三糖铁琼脂中产酸/产气，枸橼酸盐阴性，脲酶阴性，动力阴性，VP试验阴性。
3、快速诊断法：荧光菌球法 / 协同凝集试验
四、防治原则
特异性预防主要采用口服减毒活菌苗，近年试用者有Sd株、神氏 2a变异株等。但免疫力弱，维持时间短，故大规模应用还受一定限制。
治疗可用磺胺类药、氨苄青霉素、氯霉素、黄连素等。中药黄连、黄柏、白头翁、马齿苋等均有疗效。
第三节 沙门菌属
是肠杆菌科中最复杂的菌属，有2000种以上血清型。根据其对宿主的致病性，可分为三类：①对人致病；②对人和动物均致病；③对动物致病。
对人类有致病性的：
肠热症——伤寒沙门菌，甲型副伤寒沙门菌、肖氏沙门菌、希氏沙门菌
食物中毒——鼠伤寒沙门菌、猪霍乱沙门菌、肠炎沙门菌
败血症——猪霍乱沙门菌最常见
一、生物学性状
1、形态与染色：大小（0.6～1.0）×（2～3）μm，无芽胞，一般有鞭毛，无荚膜，多数有菌毛，革兰氏阴性杆菌。
2、培养特性：兼性厌氧菌，在普通琼脂平板上形成中等大小、半透明的S型菌落。在肠道杆菌选择性培养基上形成无色菌落。
3、生化反应：大多产生硫化氢。五管糖试验：不发酵2、5，发酵1、3、4，
除伤寒杆菌产酸不产气外，其他沙门氏菌均产酸产气。
4、抗原构造与分类
主要有O和H两种抗原。少数菌具有表面抗原，功能与大肠杆菌的K抗原相似，一般认为与毒力有关，故称Vi 抗原。
①O抗原：特异性多糖抗原，分组的依据，42组A~Z，刺激机体免疫系统产生IgM抗体，将菌液用乙醇或加热处理来制备O抗原。
②H抗原：蛋白质性质；同一组的沙门氏菌按照H抗原的不同分为不同的种和型;刺激机体免疫系统产生IgG抗体;将菌液用甲醛处理来制备H抗原；
③Vi 抗原：新分离的沙门氏菌有此抗原，不稳定加热或石炭酸或在人工培养基上消失；阻抑O凝集现象；刺激机体产生抗体，为带菌免疫利于带菌者的检出。
5、噬菌体分型：有些沙门氏菌在血清学分型的基础上，可借噬菌体进一步分型。分为96个噬菌体型。我国常见者有12个型。伤寒杆菌的噬菌体分型在追踪传染源及发现新型菌株上有实际意义。
6、抵抗力：不强。对热抵抗力不强，60℃ 1小时或65℃经15～20分钟可被杀死。在水中能存活2～3周，类便中可活1～2个月，可在冰冻土壤中过冬。胆盐、煌绿等对本属细菌的抑制作用较对其他肠道杆菌为小，故可用其制备肠道杆菌选择性培养基，利于分离粪便中的沙门氏菌。
7、变异
①H-O变异：有鞭毛的沙门氏菌失去鞭毛的变异
②S-R变异：失去O抗原变为R型菌落，细菌的毒力也随之消失。是第1相、部分是第2相的不同菌落。
③V-W变异：指有Vi 抗原的菌株（V型）失去Vi 抗原（W型），即细菌与抗O血清凝集而不再与抗Vi 血清凝集，称为V-W变异。
④位相变异：将具有第1相和第2相H抗原的沙门氏杆菌接种于琼脂平板上，所得单个菌落，有些是第1相，有些是第2相。如任意挑选一个菌落（第1相或第2相），在培养基上多次移种后，其后代又出现部分是第1相，有些是第2相。
二、致病性与免疫性
（一）致病物质
1．侵袭力：沙门氏杆菌侵入小肠粘膜上皮细胞，穿过上皮细胞层到达上皮下组织。细菌虽被细胞吞噬，但不被杀灭，并在其中继续生长繁殖。菌毛的粘附作用也是细菌侵袭力的一个因素。
2．内毒素：引起发热、白细胞减少。大剂量时可发生中毒性休克
3．肠毒素：有些沙门氏杆菌，如鼠伤寒杆菌可产生肠毒素，性质类似肠产毒性大肠杆菌的肠毒素。
（二）人类的沙门氏菌病
1、肠热症：是伤寒病和副伤寒病的总称，主要由伤寒杆菌和甲、乙、丙型副伤寒杆菌引起。
细菌在肠系膜淋巴结及其他淋巴组织中繁殖，经胸导管进入血流，引起第一次菌血症。第1周，称前驱期。
细菌随血流至骨髓、肝、脾、肾、胆囊、皮肤等并在其中繁殖，再次进入血流，引起第二次菌血症。第2～3周，部分病例皮肤出现玫瑰疹。
部分菌可再次侵入肠壁淋巴组织，出现超敏反应，第4周进入恢复期，患者逐渐康复。
典型伤寒的病程约3～4周。病愈后部分患者可自粪便或尿液继续排菌3周至3个月，称恢复期带菌者。约有3%的伤寒患者成为慢性带菌者。
副伤寒病与伤寒病症状相似，但一般较轻，病程较短，约1～3周即愈。
2、急性胃肠炎(食物中毒)：是最常见的沙门氏杆菌感染。多由鼠伤寒杆菌、猪霍乱杆菌、肠炎杆菌等引起。系因食入未煮熟的病畜病禽的肉类、蛋类而发病。潜伏期短，病程较短，一般2～4天内可完全恢复。
3、败血症：常由猪霍乱杆菌、丙型副伤寒杆菌、鼠伤寒杆菌、肠炎杆菌等引起。病菌进入肠道后，迅速侵入血流，导致组织器官感染，如脑膜炎、骨髓炎、胆囊炎、肾盂肾炎、心内膜炎等。出现高热、寒战、厌食、贫血等。
（三）免疫性
伤寒或副伤寒病后有牢固的免疫性，很少再感染。主要依靠细胞免疫。
体液免疫方面，局部抗体较重要，尤其是SlgA具有特异性防止伤寒杆菌粘附于肠粘膜表面的能力。有菌免疫。
三、微生物学检查与防治
（一）分离培养与鉴定
标本的采取：1周，静脉血 / 全程可采骨髓液 / 2周起，粪便尿液
肠炎型：粪便呕吐物可疑食物
败血症：血液
取可疑菌落（MAC上无色透明；SS上无色，不透明或透明，或中央为黑色的菌落）以生化/血清学试验鉴定到种。沙门菌的基本生化反应特征为乳糖阴性、在三糖铁琼脂中表现为产碱/产酸或产碱/产酸产气，H2S阳性、枸橼酸盐阳或阴性、脲酶阴性、吲哚阴性、动力阳性、VP阴性、鸟氨酸阳性。凡乳糖阳性、吲哚阳性或脲酶阳性者均不考虑为沙门菌。
（二）血清学试验
肥达反应（Widal test）：用伤寒杆菌O抗原和伤寒杆菌、甲/乙型副伤寒杆菌的H抗原与待检血作定量凝集试验。根据抗体含量多少及其增长情况，辅助临床诊断肠热症。
判定结果时必须考虑下述情况：O≥1:80感染急性期 / H≥1:160 确定感染细菌；
1、正常抗体水平：正常人因隐性感染或预防接种，血清中可含有一定量抗体，其效价随各地区情况而不同。一般说来，O凝集价≥1:80、H凝集价≥1:160时才有诊断价值。
2、动态观察：判断肥达氏反应结果须结合临床症状、病期等。单次凝集效价增高，有时不能定论。如间隔数天重复采用，若效价随病程延长而逐渐上升4倍以上，有诊断意义。
3、O/H抗体在诊断上的意义
①若H、O凝集效价均超过正常值，则感染伤寒、副伤寒的可能性大；
②H与O效价均低，则患肠热症的可能性甚小；
③若H效价高而O不高，可能系预防接种或非特异性回忆反应；
④如O效价高而H不高，可能是感染早期或其他沙门氏菌感染。
4、其他：少数病例在整个病程中，肥达氏试验始终呈阴性。可能是：①发病早期曾用大量或多种抗生素治疗；②患者免疫功能低下。故本试验阴性时，不宜匆忙地否定诊断。
四、防治
采用皮下多次接种死菌苗，虽有一定的保护作用，但常引起局部和全身反应。
可采用氯霉素、氨苄青霉素、羟氨苄青霉素等，中药白花蛇舌草，穿心莲等有效。
第四节 其他菌属
（一）克雷伯菌属：
克雷伯菌属属肠杆菌科，其代表是肺炎杆菌，即肺炎克雷伯菌(K. peneumoniae)
灰白色粘液菌落，以接种环挑之，易拉成丝，有助鉴别。 本菌存在于人体肠道、呼吸道。可引起支气管炎、肺炎，泌尿系和创伤感染，甚至败血症、脑膜炎、腹膜炎等。
1、形态结构：肺炎克雷伯菌为革兰阴性杆菌，无鞭毛，无芽孢，患者标本直接涂片或在营养丰富培养基上的培养物可见菌体外有明显的荚膜。
2、培养特性：兼性厌氧，营养要求不高，在初次分离培养基可形成较大、凸起灰白色黏液型的菌落。菌落大而厚实、光亮，相邻菌落容易发生融合。在MAC培养基上发酵乳糖产酸，形成较大的黏液型、红色的菌落，红色可扩散至菌落周围的培养基中。用接种针沾取时可挑出长丝状细丝。
3、临床意义：克雷伯菌属的细菌多感染免疫力低下的人群，是医院感染中最重要的条件致病菌。所致疾病：肺炎、脑膜炎、腹膜炎、泌尿系统感染、败血症
肺炎克雷伯菌是临床标本中常见的细菌，可引起典型的原发性肺炎。该菌在正常人口咽部的带菌率为1%～6%，在住院患者中可高达20%，是酒精中毒者、糖尿病和慢性阻塞性肺部疾病患者并发肺部感染的潜在的危险因素。
肺炎克雷伯菌肺炎亚种还能引起各种肺外感染，包括肠炎和脑膜炎（婴儿），泌尿道感染（儿童和成人）及菌血症。
近年在一些亚洲地区（特别是台湾和韩国）由肺炎克雷伯菌引起的肝脓肿等严重社区获得性侵袭性感染有上升的趋势。
4、鉴定：
（1）属的鉴定：动力阴性，鸟氨酸脱羧酶阴性（解鸟氨酸劳特菌阳性），
（2）种的鉴定：肺炎克雷伯菌吲哚阴性，而产酸克雷伯菌吲哚阳性
（二）变形杆菌（Proteus species）
广泛存在于水、土壤腐败的有机物以及人和动物的肠道中，为条件致病菌，多为继发感染，如慢性中耳炎、创伤感染等，也可引起膀胱炎、婴儿腹泻、食物中毒等。
1、生物学性状：
革兰氏阴性菌，呈多形性，周鞭毛菌，运动活泼。在固体培养基上呈扩散生长，形成迁徒生长现象（见不到单个菌落）。若在培养基中加入0.1%石碳酸或 0.4%硼酸可以抑制其扩散生长，形成单个菌落，即发生H-O 变异。
生化反应：葡萄糖＋，乳糖—，快速分解尿素
2、外斐试验：此属细菌X19、XK、X2菌株的O抗原与某些立克次体的部分抗原有交叉，可替代立克次体抗原与患者血清作凝集反应，此反应称为外斐试验（Weil-Felix test），用于某些立克次体病的辅助诊断。
非发酵菌
是一大群不发酵葡萄糖或仅以氧化形式利用葡萄糖的需氧或兼性厌氧、无芽胞的革兰阴性杆菌。 通常所讲的非发酵菌指在KIA中24小时内表面能够生长，在底部不生长的需氧革兰阴性杆菌。
【基本鉴定要求】
1、缺少糖发酵的证据，通常是在KIA或TSI培养基中无酸产生，斜面和底部均呈红色。
2、氧化酶阳性（不动杆菌、嗜麦芽窄食单胞菌、唐菖蒲伯克菌、浅黄华丽单胞菌、栖稻黄素单胞菌阴性），但并非所有氧化酶阳性的革兰阴性杆菌都是非发酵菌。
3、麦康凯平板MAC上生长很差或不生长
4、动力阳性
【重要鉴定试验】
1、葡萄糖利用（O/F试验）：蛋白胨和糖类的比例为1:5而不同于发酵菌的1:2。
2、氧化酶试验：多为阳性
3、动力：半固体培养基 应只穿刺培养基顶部4mm，在培养4-6小时后首次观察结果，24和48小时后两次观察结果。更准确的方法是湿片法和鞭毛染色。
4、色素形成：非发酵菌可形成多种色素，有助于菌种的鉴定。
5、硝酸盐还原/产气：将硝酸盐还原成亚硝酸盐，进而释放氮气。
6、吲哚试验：需用含色氨酸丰富的培养基，产吲哚黄杆菌、脑膜败血黄杆菌、食酸丛毛单胞菌等阳性。
7、硫化氢：腐败希瓦菌是非发酵菌中唯一在KIA和TSI上产硫化氢的菌种。
第一节 假单胞菌属
直或微弯无芽孢革兰阴性杆菌， OXI+，动力+（一个或多个极鞭毛），严格需氧，氧化利用葡萄糖、触酶阳性、 MAC生长，水溶性色素。
本属包括铜绿假单胞菌、荧光假单胞菌、恶臭假单胞菌、斯氏假单胞菌、门多萨假单胞菌、产碱假单胞菌和类产碱假单胞菌。
【临床意义】假单胞菌属分布广泛，人类不发酵菌感染中，假单胞菌占70％～80％，主要为铜绿假单胞菌。
培养鉴定：革兰阴性、无芽胞、专性需氧。有端鞭毛或丛鞭毛。
生长温度范围广，最适生长温度为35℃。产生各种水溶性色素：绿脓素、脓玉红素、荧光素、脓褐素
一、铜绿假单胞菌
分布广泛，是非发酵菌中最具临床意义的细菌，也是医院内感染最多见的细菌，主要引起条件感染。
感染多发生于烧伤、急性白血病、AIDS、器官移植病人及静脉药瘾者，感染多位于潮湿部位，如气管造口、留置的导管、创面、外耳道、角膜和渗出性皮肤伤口处
囊性纤维化病人呼吸道分离的铜绿假单胞菌具有生物膜（其产生的大量藻酸盐包围了菌体所致），导致本菌感染的治疗困难和高死亡率。
其淡蓝色脓性渗出物及绿脓素的生姜样气味具有特征性。
（一）致病机制
1、结构成分：粘附素、多糖似荚膜物质
2、毒素S：内毒素（LPS）/ 毒素：A阻止真核细胞蛋白质合成，S干扰吞噬杀菌作用 / 绿脓素：具有氧化还原活性，催化超氧化物和过氧化氢产生有毒基团
3、酶类：弹性蛋白酶：降解弹性蛋白，有丝氨酸蛋白酶（Las-A）和锌金属蛋白酶（Las-B）二种 / 磷脂酶C：分解脂质和卵磷脂，损伤组织细胞
（二）生物学性状
1、形态与染色：细长革兰阴性杆菌，长短不一，极单鞭毛
2、培养特性：严格需氧，氧化利用葡萄糖、 McC生长，最适生长温度35℃，4℃不生长，42℃可生长
在普通琼脂平板上产生特征性的蓝绿色水溶性绿脓素和黄绿色青脓素（荧光假单胞菌和恶臭假单胞菌也可产生）；血平板上形成大而扁平，湿润，边缘不齐，有金属光泽，有生姜气味的灰绿色菌落，并形成透明溶血环；有时可产生水滴样菌落，无色素不溶血（囊性纤维化病人）
3、耐药性：本菌对氨苄西林、安美汀、四环素、优力新、一/二代头孢菌素、头霉素、大环内酯类、磺胺等天然耐药，各种抗生素治疗过程中都可能发生耐药，耐药率及多重耐药株上升较快。
机制：生物膜及外膜障碍、胞外灭活或钝化酶、主动外排系统将抗生素泵出胞外、抗菌药物作用靶位改变、整合子（1类，3类）
（三）微生物学检验
1、标本采集：按疾病和检查目的，分别采 取不同的标本：患者的血液、脑脊液、胸(腹)水、脓液、分泌液、痰、尿液、十二指肠引流液、粪便等；医院病区或手术室的空气、水、地面、把手、医疗诊断器械及生活用品。
2、标本镜检为革兰阴性，有动力的杆菌
3、分离培养：普通培养基经18—24h形成圆形、扁平隆起、光滑湿润菌落。大多数产生绿脓素或荧光素。少数可产生其他颜色色素，如红脓素（红色），黑脓素（棕色到黑色），青脓素（黄色）。 McC经18—24h形成微小无光泽半透明菌落， 48h菌落中心呈棕绿色
4、生化鉴定：氧化酶阳性，氧化分解葡萄糖、木糖产酸不产气，液化明胶，还原硝酸盐产生氮气，吲哚阴性，利用枸橼酸盐，精氨酸双水解酶阳性。
5、结果分析与报告：结合临床感染症状进行分析
患者血、尿液及无菌体液中分离到铜绿假单胞菌，特别是反复检出即可确定是感染病原菌。如无感染的临床表现，应作为正常菌群。
（四）感染的控制
易感危重病人不应安排在已有过铜绿假单胞菌感染的病房；各种抗菌药物、溶液、软膏、器械等应避免被铜绿假单胞菌污染；采取适当的分型方法对感染菌株进行流行病学调查和监控。
二、荧光假单胞菌
产青脓素，但不能产绿脓素， 4℃生长，42℃ 不生长，最适温度25-30℃ 。
见于水和土壤中，都可作为咽部的正常菌群存在，是人类少见的条件致病菌
荧光假单胞菌和污染的血制品关系密切，可见于近期接受过血液制品而致菌血症的患者。
第二节 窄食单胞菌属
嗜麦芽窄食单胞菌
是临床实验室中第三位最常见的非发酵菌，下列特征可用来推测性鉴定：在血平板或麦康凯平板上生长良好、氧化酶阴性、O/麦芽糖产酸，但O/葡萄糖可阴性、赖氨酸脱羧酶阳性、一些菌株产黄色色素
抗生素敏感方式：对大多数抗生素耐药，包括氨基糖苷类和碳青霉烯类，但对TMP/SMZ（复方新诺明）敏感。
（一）生物学性状
1、嗜麦芽窄食单胞菌为有动力杆菌，具有丛极鞭毛，血平板上菌落粗糙呈淡黄色或浅绿色，有氨气味。
2、根据 赖氨酸脱羧酶试验阳性和DNA酶阳性、氧化酶阴性可很容易与其他假单胞菌区别，本菌葡萄糖氧化缓慢，可快速氧化分解麦芽糖。
3、本菌的一个重要特征是对氨基糖苷类抗生素、碳青霉烯类天然耐药，但TMP/SMZ天然敏感。
（二）致病性
引起本菌定植和感染的危险因素有：机械通气、广谱抗生素的预防性应用、化疗、插管和中性粒细胞减少等。
嗜麦芽窄食单胞菌分布广泛，可引起条件感染是一种重要的医院获得性病原体，本菌可分离于几乎所有部位，最常见的是呼吸道。本菌可致多种疾病，包括肺炎、菌血症、心内膜炎、胆管炎、脑膜炎、尿道感染和严重的伤口感染等。
第三节 不动杆菌属
1、鉴定要点：
革兰阴性球杆菌。无动力
氧化酶－，硝酸盐还原－，KIA：底层斜面不变色
注意：与形态相似的奈瑟菌鉴别；与不分解糖的产碱杆菌鉴别
2、致病性：
不动杆菌所致疾病包括肺炎、心内膜炎、脑膜炎、皮肤和伤口感染、腹膜炎和尿道感染等。
不动杆菌对青霉素、氨苄青霉素和头孢他啶均耐药，大多数菌株对氯霉素耐药，对氨基糖苷类抗生素耐药的菌株也逐渐增多，不同菌株对二代和三代头孢菌素耐药性不同，所以每个分离菌株都应进行药敏试验。多重耐药菌株最常多见于鲍曼不动杆菌和溶血不动杆菌。
鲍曼不动杆菌
（一）临床意义
广泛分布于自然和医院环境中，能在潮湿和干燥的表面生存，也可存在于健康人的皮肤，在非发酵菌中，本菌是在临床标本中的分离阳性率仅次于铜绿假单胞菌，居第二位的条件致病菌，通常不动杆菌对健康人体不致病，但对体弱者可引起感染。
本菌能够获得多重耐药性和能够在大多数环境表面生存，所以由本菌引起的医院获得性感染有增加的趋势，医院获得性感染最常见的是呼吸道或手术部位、应用器械或ICU的住院患者。
（二）生物学性状
1、形态与染色：常似双球菌，有时不易脱色，易误认阳性菌
2、培养特性与生化反应：
严格需氧、OF试验为产碱型、无动力、氧化酶阴性、硝酸盐还原阴性、枸橼酸盐阳性的革兰染色阴性球杆菌。
血平板培养24小时后，菌落大小0.5-2mm，半透明到不透明，凸起，边缘整齐，无色素形成；大多数菌株麦康凯平板上生长良好，呈无色或淡粉红色。
弧菌属
弧菌属（Vibrio）为一大群菌体短小，弯曲成弧，G-单毛菌，运动极活泼，分布广泛，多存在于水中，对人有致病性主要为霍乱弧菌和副溶血弧菌。
共同特征
为革兰阴性菌，弯曲成弧形或直杆状，具有一端单一鞭毛，运动迅速
兼性厌氧，发酵利用葡萄糖，氧化酶＋（除麦氏弧菌外）
对弧菌抑制剂O/129敏感，钠离子能刺激其生长，除霍乱弧菌和拟态弧菌外其他菌种为嗜盐菌
第一节 霍乱弧菌
一、生物学特性
1、形态染色：
革兰染色阴性，弧形或逗点状。菌体一端有单鞭毛，悬滴镜检呈穿梭或流星样运动；在病人“米泔水”样便中，可呈头尾相接的“鱼群”样排列。O139群有荚膜。
2、培养特性：
营养要求不高，兼性厌氧。最适生长温度37℃，具耐碱性，初次分离选用pH8.5的碱性胨水增菌培养，经35℃4h-6h在液体表面形成菌膜。
在硫代硫酸盐-枸橼酸盐-胆盐-蔗糖琼脂平板(TCBS)上菌落呈黄色；在含亚碲酸钾的平板上（糖双洗琼脂平板、庆大霉素琼脂平板）菌落中心灰褐色（碲离子还原为金属碲）；可在无盐培养基上生长（ NaCl 浓度0-6%） ， E1-Tor生物型在BAP可形成β溶血环。
3、生化反应：
氧化酶（+）、葡萄糖发酵（+）、蔗糖发酵（+）、吲哚（+）
4、抗原和分型：
霍乱弧菌有不耐热的H抗原和耐热的O抗原。根据O抗原的不同分为O1群霍乱弧菌和非O1群霍乱弧菌，其中O1群、O139群引起霍乱。O1群霍乱弧菌分为古典生物型和E1-Tor 生物型。
O1群霍乱弧菌根据O抗原的A、B、C三种抗原成分组成不同分成三个血清型，小川型：含A、B 抗原 / 稻叶型：含A、C抗原 / 彦岛型：含A、B、C 抗原。
5、抵抗力：
较弱，干燥时易死亡，水环境中可存活两周（水源性传播，水性爆发）；怕酸——正常胃酸4min；不耐热——100℃，1-2min；对消毒剂敏感，可用漂白粉处理病人的排泄物或呕吐物。
二、致病性与免疫性
1、致病物质：鞭毛、菌毛
霍乱弧菌肠毒素（CT）：CT由一个A亚单位和5个相同B亚单位组成多聚体蛋白。
A亚单位包含A1和A2两部分，以二硫键相连。A1为毒素活性单位， 激活腺苷酸环化酶（cAMP酶），使细胞内cAMP大量增加。 A2连接A1和B亚单位。
B亚单位与肠粘膜上皮细胞膜上的神经节苷脂GM1受体结合
致病机理：霍乱弧菌进入肠道粘附于肠粘膜上皮细胞，分泌CT，其B亚单位结合细胞膜上GM1受体形成通道，A1进入细胞内激活cAMP酶，细胞内cAMP大量增加，分泌亢进导致严重呕吐和腹泻
临床表现：前驱期、吐泻期、脱水期、恢复期
2、所致疾病：霍乱，在我国属甲类传染病
传染源：病人和无症状感染者的粪便污染的水源和食物。
传播途径：经口传播
潜伏期：2-3d
临床表现：剧烈吐泻、米泔样，每日数十次，持续2-3天，大量失水，严重吐泻引起水电解质紊乱，脱水酸中毒，肾衰、循环衰竭、休克、死亡；及时补充液体和电解质非常重要，可大大降低死亡率。
免疫力：病人愈后可获得牢固免疫
三、微生物学检查法
1、标本直接检查
（1）直接镜检 ：革兰染色，观察有无“鱼群”样排列的革兰阴性弧菌。
（2）动力和制动试验 ：“米泔水”样便制成悬滴标本，直接观察有无呈穿梭样运动的细菌。在悬液中加入1滴霍乱多价诊断血清，若细菌停止运动并发生凝集，则为制动试验＋。
（3）直接荧光抗体染色和抗O1群抗原的单克隆抗体凝集试验，
（4）霍乱毒素的测定：ELISA法或乳胶凝集测定CT
2、分离培养与鉴定
将标本接种于碱性胨水，35℃ 6~8 h接种至TCBS平板或双洗琼脂平板或庆大霉素琼脂平板，霍乱弧菌在TCBS上形成黄色，双洗琼脂或庆大霉素琼脂平板上呈灰褐色中心的菌落。
用O1群和O139群霍乱弧菌的多价和单价抗血清进行凝集，结合菌落特征和菌体形态，作出初步报告。
依据全面生化反应，血清学分群及分型进行最后鉴定。符合霍乱弧菌的菌株需区分古典生物型和E1-Tor 生物型。
对病原性弧菌的主要鉴定试验为：赖氨酸脱羧酶、鸟氨酸脱羧酶和精氨酸双水解酶。霍乱弧菌为+ + -。
3、初筛试验：
（1）霍乱红试验：
（2）粘丝试验：霍乱弧菌浓悬液＋0.5％去氧胆酸钠，1’内由混变清，再变粘稠，弧菌属细菌除副溶血性弧菌部分菌株外，均有此反应；
（3）O/129敏感试验
四、防治原则
（1）加强国境检疫，加强水源及粪便管理
（2）及时检出病人，隔离封锁疫区
（3）疫苗接种
（4）对症治疗，及时补充液体和电解质，预防大量失水引起的低血容量性休克和酸中毒，及时抗菌治疗。
分枝杆菌属
是一类细长、略带弯曲、呈分枝状生长的细菌，革兰染色阳性，无芽胞、无荚膜。抗酸染色阳性，故又称抗酸杆菌。营养要求较高，常用罗琴培养基，生长缓慢，2~8周后方可见菌落。
结核分枝杆菌
是结核病的病原体。结核病在上世纪40、50年代发病率和死亡率很高，60~80年代经过人们的努力，大大降低，80年代后期，发病率又有所上升，主要是因为耐药性的出现。
一、临床意义
本菌抵抗力强，可存活6~8月，随着漂浮于空气中的微滴核被吸入呼吸道，植入肺泡发育繁殖导致结核。引起结核病，随社区人群生活状况不同发病率有所差异，全球约有1/3人感染，有人类死亡之首和白色瘟疫之称。
二、生物学性状
1、形态染色：
①细长、略弯曲杆菌，牛型结核分枝杆菌稍短。排列成团、成堆
②抗酸染色阳性，治疗后菌体呈非抗酸性G+颗粒，称much颗粒（L型变异）
③金胺“O”染色菌体：呈黄色荧光
2、培养特性
最适温度35~37℃，最适pH6.4~6.8。专性需氧，在液体培养基上形成菌膜，有毒株呈索状生长
营养要求高，专性需氧，专嗜甘油为碳源，常用罗琴培养基(鸡蛋、甘油、枸橼酸钠、天门冬酸、马铃薯粉、孔雀绿、钾镁离子)，繁殖慢，增殖一代需要18小时，在固体培养基上2～5周才出现肉眼可见的菌落，为菜花样，凸起、不透明、粗糙，牛型结核分枝杆菌为光滑型。
3、 生化反应：
烟酸试验(+)， 硝酸盐还原(+)， 中性红(+)，烟酰胺酶试验(+)， 脲酶试验(+)，牛型分枝杆菌均为阴性。糖类发酵(- ) ，热触酶(- ) ，Tween水解(- )；
热触酶(- ) 热磷酸酶(- )，为结核分枝杆菌和非结核分枝杆菌鉴定试验 ，后者阳性
4、抵抗力：强
温度：菌悬液80℃5min、痰标本煮沸5min完全杀死细菌
光线：对紫外线敏感
干燥：对干燥或干热抵抗力强，干燥痰中可存活数周
化学因素：75%乙醇5min，石炭酸、来苏儿、甲醛敏感
5、结核杆菌多种性状可发生变异如：菌落变异、毒力变异等。菌落变异由粗糙型变成光滑型。
毒力变异 → 卡介苗（BCG）： 1908年两位科学家将有毒的牛型分枝杆菌接种在含甘油、胆汁、马铃薯的培养基中，经13年230代传代获得的减毒菌株，即卡介苗，沿用至今。
三、免疫性与致病性
1、免疫性：
有菌免疫或称传染性免疫，细胞免疫在抗感染免疫中起重要作用。
本菌可经血、淋巴，在骨、关节、肾、脑膜等处引起相应的结核病
2、致病物质：
（1）荚膜：抗吞噬
（2）细胞壁脂质 / 磷脂：单核细胞增生，结核结节形成，干酪样坏死
（3）分枝菌酸：抗酸性
（4）索状因子：破坏线粒体膜
（5）蜡质D：IV型变态反应
（6）硫酸脑苷脂：抑制吞噬细胞
3、致病机制：Ⅳ 型超敏反应
结核结节的形成：是单核细胞参与的炎性肉芽肿反应，是细胞免疫和IV型变态反应平衡的结果。细菌的脂质抵抗吞噬，巨噬细胞被破坏，形成原发感染。3~6周后，细胞变形，IV型变态反应产生，磷脂刺激巨噬细胞转化为上皮样细胞融合成多核巨细胞。抑制蛋白酶对组织溶解，产生干酪样坏死。
4、Koch现象（郭霍现象）和IV型变态反应：
有毒结核分枝杆菌被初次接种豚鼠10－14天，局部产生小节，形成肿块→坏死溃疡侵入附近淋巴结→淋巴血流全身播散，经久不愈→动物死亡。说明初次感染，机体无免疫力和超敏反应
在8~12周之前先动物接种减毒小量结核分枝杆菌，再次接种结核分枝杆菌后局部反应提早出现，2~3天内红肿硬结溃疡痊愈。说明再次感染，机体有免疫力和超敏反应
三、微生物学检查
1、标本采集：
根据病变部位不同而定(晨痰、支气管洗液、清晨的中后段尿)。运送: 消毒容器
2、直接检查：
萋-尼 抗酸染色(热)、Kinyoum染色(冷)，金-胺0染色
痰涂片要厚，齐-尼 抗酸染色后，观察至少100个视野，结核分枝杆菌抗酸染色后呈红色，其他细菌和细胞为蓝色。结果应报告“找到或未找到抗酸性杆菌”，而不能报告“找到结核分枝杆菌”。
3、消化：
4% NaOH 37℃ 15~30分钟；胰酶-新洁尔灭法；4%硫酸法（尿标本）
4、培养分离、生化反应：烟酸、硝酸盐还原、触酶
标本接种于选择性固体培养基中，常用罗琴培养基，所含的孔雀绿或青霉素可抑制杂菌生长37℃，5％~10％CO2培养8周，如果出现干燥呈颗粒状、灰白色菌落，涂片染色为抗酸阳性，多数是结核杆菌。
5、药物敏感试验
6、鉴定：
①PCR反向膜探针杂交EHSA法(PCR杂交梳)；②DNA探针；③16s rRNA基因序列测定；④高效液相色谱(HPLC)检测
快速分离鉴定：采用放射性（14-C）棕榈酸的7H12培养液，细菌生长后生成（14 CO2），能自动显示测定结果，有Bactec 460系统、BacT/Alert等
7、结核菌素试验和卡介苗
①结核菌素试验：结核病是病原体和宿主相互作用，由细胞免疫介导的免疫病理反应和组织损伤的结果。流行病学调查使用5U的OT和PPD，若1TU呈强阳性，提示有活动性的结核
②卡介苗：结核分枝杆菌易发生形态、菌落、生长温度、毒力以及耐药性的变异
卡介苗（BCG）是有毒力的牛型结核分枝杆菌在甘油、胆汁和马铃薯的培养基中经13年230次传代而获得的减毒变异株。现已广泛用于人类结核病的防治。
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病毒总论
病毒（virus）：最微小的、结构最简单的非细胞型微生物。
特征体积非常微小，必须用电子显微镜放大几万至几十万倍后方可观察；结构简单，无完整细胞结构，仅有一种核酸（RNA或DNA）；严格的细胞内寄生性，只能在一定种类的活细胞中增殖；对抗生素不敏感，但对干扰素敏感。
病毒的大小与形态
病毒体（virion）：完整成熟的病毒颗粒。
①大小：nm，比细菌小的多，细菌的测量单位是μm。
②形态：球形、杆形（丝形）、弹性、砖形、蝌蚪状，多数呈球形的。
病毒的结构与化学组成
（一）病毒的结构
病毒的基本结构有核心和衣壳，二者构成核衣壳。有的病毒核衣壳外有包膜和刺突，有的没有。根据包膜有无可分为：裸病毒（naked virus）、包膜病毒（enveloped virus）
1、病毒核心：成分为核酸，病毒基因组，控制病毒的遗传性状。
2、病毒衣壳：包绕在核酸外面的蛋白质外壳。具有抗原性，可以刺激机体发生免疫应答；具有保护核酸免受外界环境的破坏，比如核酸酶等；介导病毒进入宿主细胞。
根据壳粒排列方式不同，病毒有三种对称型：螺旋对称、二十面体立体对称、复合对称
①螺旋对称：有些病毒粒子呈杆状或丝状，其衣壳形似一中空柱，电镜观察可见其表面有精细螺旋结构。在螺旋对称衣壳中，病毒核酸以多个弱键与蛋白质亚基相结合，能够控制螺旋排列的形式及衣壳长度，核酸与衣壳的结合也增加了衣壳结构的稳定性。烟草花叶病毒(TMV)是螺旋对称的典型代表。
②20面体立体对称：有些病毒的外形呈“球状”，实际上是一个立体对称的多面体，一般为二十面体。它由20个等边三角形组成，具有12个顶角，20个面和30条棱。腺病毒是二十面体对称的典型代表。二十面体病毒有的也具有包膜。
③复合对称：两种对称方式同时存在：T噬菌体，头部呈立体对称（二十面体），尾部为螺旋对称。逆转录病毒内部是螺旋形的核心，外部是二十面体的外壳，是复合对称型病毒。
3、病毒包膜：病毒出芽释放时从宿主细胞膜获得，有些包膜表面有刺突。有包膜的病毒对脂溶剂敏感。
（二）病毒的化学组成与功能
1、核酸：仅含一种核酸，DNA或RNA，借此分为DNA和RNA病毒两大类。形状不同（单一线性、双股环状）。完整性不同（完整的、分节段的）。功能：决定病毒的复制、感染及遗传变异。感染性核酸：失去衣壳裸露的仍具有感染性的病毒的核酸。
2、蛋白质：包括结构蛋白和非结构蛋白
结构蛋白： 组成病毒体的成分。衣壳蛋白、包膜蛋白、基质蛋白—连接衣壳蛋白与包膜蛋白的部分，有跨膜及锚定功能区
非结构蛋白：病毒内—酶，RDRP / 感染细胞内—特殊作用蛋白
功能：结构功能：构成病毒粒子外壳，保护核酸 / 吸附：决定病毒感染的特异性 / 参与病毒大分子合成（酶类）/ 破坏宿主细胞膜与细胞壁 / 具有抗原性，能刺激机体产生抗体
3、其他组分：
脂类：0-20%，存在于包膜病毒，来源于寄主细胞，引起机体发热、中毒 ；
碳水化合物：0-3%，多结合形成包膜病毒的糖蛋白
水： ≤50%, 以结合态存在于病毒粒子中
病毒的增殖
（一）病毒的增殖方式
自我复制（self replication），即以病毒核酸为模板进行复制的方式。
病毒没有细胞结构和代谢系统，必须在活的易感细胞内进行增值，由宿主细胞为其提供酶系统、能量、原料、和生物合成的场所，以病毒的核酸为模板进行核酸复制和蛋白质合成，再装配成子代病毒，称病毒的复制。
复制周期：吸附、穿入、脱壳、生物合成、组装与成熟、释放
1．吸附（adsorption）：
病毒的吸附位点与宿主细胞表面受体的结合，首先是静电结合，是可逆的，然后是真正的结合，变得不可逆。病毒具有组织亲嗜性，也就是说，一种病毒并不能对所有的组织进行感染，是有选择的，比如，HIV只选择性的侵犯人淋巴细胞，这是由受体和配体的特异性结合决定的。
2、穿入（penetration）：
吸附后进入细胞内，有两种方式，
①吞饮，病毒与细胞表面结合后凹入细胞内，无包膜病毒多以此种方式进入细胞内，
②融合，病毒包膜与细胞膜结合，两种膜融合，将病毒的衣壳释放到细胞内。
（其实还有③转位作用：病毒衣壳蛋白与细胞膜上的特定蛋白相互作用，导致病毒直接穿过细胞膜，这种进入的方式较为少见。④直接注入，噬菌体）
3、脱壳（uncoating）：
脱去衣壳、核酸裸露。不同病毒脱壳方式不同：
①注射式侵入的噬菌体和某些直接侵入的病毒可以直接在细胞膜或细胞壁表面同步完成侵入和脱壳。
②多数病毒在宿主细胞溶酶体酶作用下脱壳。
③少数病毒脱壳过程比较复杂，如痘病毒：在溶酶体酶作用下，先部分脱壳，暴露部分核酸，转译病毒脱壳酶后，再完全脱壳。
4、生物合成 （biosynthesis）：
宿主细胞内进行的，在病毒基因控制下的病毒核酸和蛋白质的合成过程。先合成一些复制酶、抑制蛋白，抑制宿主细胞的正常代谢，使细胞代谢向着有利于病毒合成的方向进行（早期）。再依据病毒基因组的指令，进行病毒核酸的复制、转录和翻译（晚期）
早期合成非结构蛋白，晚期合成结构蛋白。
区域：DNA病毒 → 核内（除痘病毒）/ RNA病毒 → 胞质（除流感病毒、部分副粘病毒及HIV）
5、装配与成熟（assembly）：
组装有的在核内完成，有的在胞质内完成，组装成成熟的子代病毒，并从细胞游离出来。无包膜病毒组装成核衣壳即为成熟的子代病毒，包膜病毒组装核衣壳后还需要获得包膜才成为成熟的病毒体。
病毒核酸与病毒蛋白→核衣壳
①组装部位不同：
DNA病毒(除痘病毒外)：核内组装(如：ADV等) / RNA病毒：多数在胞浆内组装(如：Polio等)
②组装方式不同：
以核酸为支架，壳粒按螺旋对称方式排列 / 先形成20面体衣壳，核酸进入，形成核衣壳
6、释放：
①出芽释放：多见于包膜病毒，细胞膜可被修复，不直接破坏宿主细胞
②溶细胞性释放（细胞崩解）：多见于裸病毒，宿主细胞损伤、崩解，释放出大量的子代病毒
③其他方式：如巨细胞病毒 ，通过细胞间桥或细胞融合传播。
（二）病毒的异常增殖和干扰现象
1. 缺陷病毒（ defective virus ）：因病毒基因组不完整，单独培养时不能复制出完整有感染性的病毒颗粒，称缺陷病毒；但当与另一种病毒（辅助病毒）在细胞内共同生长时，则可正常增殖。
缺陷干扰颗粒（DIP）：缺陷病毒不能复制，但却能干扰同种成熟病毒体进入细胞。
2. 辅助病毒：可以辅助缺陷病毒完成正常增殖的病毒。如HBV与HDV，HDV为缺陷病毒，HBV为其辅助病毒，
3. 顿挫感染：病毒进入宿主细胞后，如细胞不能为病毒增殖提供所需要的酶、能量及必要的成分，则病毒在细胞中不能合成本身的成分，称为顿挫感染。（非容纳细胞、容纳细胞）
4. 干扰现象：两种病毒感染同一种细胞，常发生一种病毒抑制另一种病毒复制的现象，称干扰现象。
机制：IFN、受体、DIP。
病毒的致病作用
（一）病毒感染的传播方式
1、水平传播：病毒在人群不同个体之间的传播。
2、垂直传播：病原体从宿主的亲代到子代，主要通过胎盘或产道传播。
（二）病毒感染的致病机制
1、病毒感染对宿主细胞的直接作用（细胞水平）
（1）杀细胞效应：病毒在细胞内复制成熟，并于很短时间内大量增殖，引起细胞裂解，释放出病毒，在普通显微镜下可见到明显的细胞病变（CPE）
（2）稳定状态感染：有些病毒在细胞内增殖不引起细胞溶解死亡，也不阻碍细胞代谢，呈稳定状态感染，称为非溶解细胞病毒。所引起的感染称为稳定状态感染。比如：细胞融合（cell fusion）、细胞膜出现新抗原(new antigen presented in cell membrane)
（3）包涵体形成：有些病毒感染的细胞在显微镜下可观察到胞质或核内出现嗜酸性或嗜碱性，圆/椭圆形/不规则形状的团块结构，大小、数目不等，称为包涵体（inclusion ） 。
（4）细胞凋亡：病毒可诱导细胞的程序性死亡
（5）基因整合与细胞转化：某些病毒感染细胞后将其核酸插入到细胞的染色体中引起整合感染，可引起细胞某些遗传性状的改变。整合可导致：可引起细胞遗传改变——细胞转化；也可发生细胞恶化——肿瘤相关病毒。转化细胞可发生增殖变快，不再具有细胞间接触抑制，可无限制生长繁殖。与肿瘤形成密切相关。
与人类恶性肿瘤密切相关的病毒：HIV、人乳头瘤病毒、HBV、EB病毒、人T细胞白血病病毒I 型等。
2、病毒感染的免疫病理作用（机体水平）
（1）抗体介导的免疫病理作用
病毒感染后，病毒抗原可出现于宿主细胞表面，与抗体结合后，激活补体，导致宿主细胞破坏，属于II型超敏反应。
病毒抗原与抗体形成复合物，沉积在身体任何部位导致损伤，属于III型超敏反应。
（2）细胞介导的免疫病理作用
致敏的细胞毒T细胞在清除胞内病毒的同时，对靶细胞膜病毒抗原识别后进行杀伤，属于IV型超敏反应。
（3）病毒感染对免疫系统的致病作用
病毒侵犯免疫细胞，导致免疫应答降低；
病毒感染引起自身免疫性疾病：机体失去对自身与非自身异己抗原的识别能力
病毒的检测
一、标本的采集与送检（principle of collection specimen）
标本采集：早期；不同病变取不同标本
标本处理：无菌操作；杂菌标本+抗生素
冷藏速送：快速送检；冷藏（-70℃）
血清学标本：取双份血清，效价升高4倍有诊断价值
二、病毒的分离培养与鉴定
（一）病毒的分离培养：从病人的标本中分离、增殖病毒的技术。由于病毒具有严格的活细胞内寄生的特性, 只能在一定的活细胞内增殖, 所以必须借助于实验动物、鸡胚和组织来进行分离培养。
1、动物接种：是最原始的病毒培养方法，根据病毒种类不同，选择敏感动物及适宜接种部位，如嗜神经性病毒（狂犬病毒）可接种于小鼠脑内，痘病毒可接种于家兔角膜或皮内。
2、鸡胚培养：鸡胚对多种病毒敏感。一般采用孵化9～14天的鸡胚，根据病毒种类不同，将病毒标本 接种于鸡胚的不同部位，最常用的鸡胚接种部位有：羊膜腔、尿囊腔、绒毛尿囊膜和卵黄囊等。
3、组织培养法 (tissueculture) 或细胞培养 (cellculture)法：是将离体活组织块或分散的组织细胞加以培养的技术总称，为病毒分离鉴定中的最常用的基本方法。
细胞培养据生长方式可分：单层细胞和悬浮细胞 / 根据来源级传代次数可分：原代细胞，二倍体细胞，传代细胞。
（二）病毒的鉴定
1、细胞形态学改变
（1）细胞病变效应(cytopathic effect, CPE)：大多数病毒属于溶细胞型感染，在敏感细胞内增殖会出现CPE现象，表现为细胞内颗粒增多、圆缩、聚集或聚合，有的可形成包涵体，最后出现细胞溶解、脱落、死亡等。有包膜病毒多以“出芽”方式释放，一般不直接引起细胞死亡，因而不出现CPE或所致病变轻微，不易察觉。
（2）包涵体（inclusion Bodies）：某些细胞在感染病毒后，出现于细胞质或细胞核内的，在光镜下可见的，大小、形态和数量不等的小体称为包涵体。由于不同病毒包涵体的大小、形状、组分以及存在于宿主细胞中的部位均不同，所以包涵体可用于病毒的快速鉴别和某些病毒疾病的辅助诊断指标；
通常DNA病毒产生核内包涵体（如单纯疱疹病毒、腺病毒、巨细胞病毒等），RNA病毒产生胞浆内包涵体。
（3）多核巨细胞（multinucleated giant cell ）：被感染细胞膜融合而成。
2、红细胞吸附（hemoadsorption，HAd）：流感病毒或副流感病毒感染细胞后，由于细胞膜上出现凝集素，具有吸附脊椎动物红细胞的能力的现象。
3、干扰现象（interference phenomenon）：一种病毒感染细胞后可以干扰另一种病毒在该种细胞中的增值的现象。
4、细胞培养液pH的改变：病毒感染细胞的结果可使培养液的pH值改变，说明细胞的代谢在病毒感染后发生了变化。这种培养环境的生化改变也可作为判断病毒增殖的指标。
5、病毒的定量测定(Determination of virus titer）
（1）空斑形成单位(plaque-forming unit, PFU)：是计量病毒（或噬菌体）的一种单位，但只限于用在有产生空斑能力的病毒。
其原理是：用少量有破坏宿主细胞能力的病毒去感染已形成致密单层状态的宿主细胞群体时，经过一定培养时间使每个感染细胞周围的细胞逐渐感染崩溃，形成肉眼可见的空斑。每一蚀斑是由一个感染性病毒颗粒形成的，称蚀斑形成单位(plaque forming unit,PFU)，病毒悬液中的感染性病毒量以每毫升的蚀斑形成单位来表示：pfu/ml
（2）半数致死量(LD50)或半数组织感染量(TCID50)
半数致死量(LD50)：表示在规定时间内，通过指定感染途径，使一定体重或年龄的某种动物半数死亡所需最小病毒量。
半数组织感染量(TCID50)：病毒感染鸡胚、动物或细胞后，引起 50% 发生死亡或病变的最小量，称 ~ 。此法可以估算所含病毒的感染量，不可准确测定感染性病毒颗粒的数量，为半定量
（三）病毒的血清学诊断
原理：是用已知病毒抗原来检测病人血清中有无相应抗体，故须待病人感染后体内产生抗体时才能检出。
常用方法：
1、中和试验（Nt）：是病毒在活体内或细胞培养中被特异性抗体中和而失去感染性的一种试验。
中和抗体(netralizing antibodies,NTAb)是作用于病毒表面抗原(衣壳或包膜)的抗体，同种不同型病毒间一般无交叉，特异性高，而且抗体在体内维持时间长。
中和抗体阳性不一定表示正在感染中，也可能因以前有过隐性感染所致。因此，中和试验适用于人群免疫情况的调查，在临床诊断上较少使用。
2、补体结合试验（CFT）：用已知病毒可溶性补体抗原来检测病人血清中相应抗体。
补体抗原是病毒的内部抗原，同种异型间常有交叉，故特异性较中和试验低。但补体抗体出现较早，消失较快，故补体抗体阳性可作为近期感染的指标。
3、血凝抑制试验（HI test）：具有HA的病毒能凝集鸡、豚鼠、人等的红细胞，称血凝现象。这种现象能被相应抗体抑制，称HI试验。
其原理是相应抗体与病毒结合后，阻抑了病毒表面的HA与红细胞的结合。本试验简易、经济，特异性高，常用于粘病毒及乙型脑炎病毒感染的辅助诊断及流行病学调查，也可鉴定病毒的型与亚型。
病毒 +鸡RBC = 凝集（血凝试验）
病毒 +特异性抗体 +鸡RBC=不凝集（血凝抑制试验）
4、免疫扩散试验：琼脂扩散为可溶性抗原与抗体在琼脂凝胶中所呈现的一种沉淀反应。
（四）病毒的快速诊断
1、形态学检查
①光镜：大病毒、包涵体
用光学显微镜直接检查某些细胞、包涵体：巨细胞病毒包涵体、麻疹病毒感染形成多核巨细胞 狂犬病脑组织神经细胞胞质中包涵体（Negri 氏小体）等
②电镜：直接电镜、免疫电镜
用电子显微镜观察病毒颗粒的形态，适于检查含高浓度病毒的标本用于甲型肝炎病毒、轮状病毒等的检测
近年来利用特异性免疫血清与标本混合孵育后，用免疫电镜法检测，提高阳性率，用于轮状病毒、鼻病毒、甲型和戊型肝炎病毒、疱疹病毒等的检测
2、检查病毒性抗原
①免疫荧光法（IFT）：可快速、早期检测难以培养的病毒，
②酶联免疫吸附检测法（ELISA）：可用分光光度比色计或肉眼观察结果，无需特殊设备。
3、检查病毒抗体
①血凝抑制试验：用于流感、副流感和流行性乙型脑炎。因这些病毒可凝集动物红细胞，加入相应抗体后可抑制血细胞凝集现象
②补体结合试验：用于流感、流行性乙型脑炎。用含已知病毒抗原，检查病人血清中未知抗体
③中和试验：用于人群免疫水平的调查
④酶联免疫吸附试验：已知抗原来测定抗体
4、病毒核酸的检测
①PCR：PCR是试管内特异性DNA片段扩增法，将DNA片段扩增10万倍，提高了试验的特异性和敏感性。逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）也可特异性的扩增RNA片段。近年来成为临床病原诊断的重要工具
②核酸杂交技术：
Southern blot：用于酶解后DNA片段的分子杂交检测
Northern blot：用于酶解后RNA片段的分子杂交检测
Western blot：蛋白免疫印迹试验，用于蛋白质转染技术
③生物芯片技术
呼吸道病毒
呼吸道病毒是指一大类能侵犯呼吸道，引起呼吸道局部病变或仅以呼吸道为入侵门户，主要引起呼吸道外组织器官病变的病毒。90%以上的急性呼吸道感染由该类病毒引起。主要包括正粘病毒科、副粘病毒科、小RNA病毒科、冠状病毒科等。
临床特点：
传染源为病人及病毒携带者；飞沫传播，传染性强；潜伏期短，发病急；感染可发生在呼吸道任何水平；病后免疫力不牢固；同一病毒的反复感染，不同病毒引起同一疾病表现。
正粘病毒
正粘病毒原来只有流行性感冒病毒一个种，流感病毒(influenza)为流感的病原体，
A、流行性感冒病毒
分型：有三型：
据RNP和M蛋白抗原性分：甲、乙、丙三型。甲型根据HA和NA抗原性不同，又分若干亚型（H1~H16、N1~N9）。乙型、丙型至今未发现亚型。
甲型流感病毒抗原易发生变异，曾多次引起世界性大流行。
乙型流感病毒对人类致病性较低，常局部爆发；
丙型流感病毒主要侵犯婴幼儿或只引起人类轻微的上呼吸道感染，很少流行。
一、生物学性状
（一）形态与结构
流感病毒呈球形或丝状，直径80-120nm，新分离株丝状多于球形。
结构：主要包括病毒核酸与蛋白组成的核衣壳和包膜
1、核心：分节段的（-） ssRNA、核蛋白（NP）、RNA多聚酶（三种依赖RNA的RNA多聚酶蛋白），呈螺旋对称。
2、包膜：内层为基质蛋白（MP），也具型特异性，外层为脂质双层（源于宿主细胞膜）。
基质蛋白（M蛋白）：覆盖在核衣壳外面，抗原性稳定，也具有型特异性。M1(促进病毒的装配)、M2(膜蛋白，为离子通道，辅助HA2释放核衣壳)
包膜上镶嵌两种刺突，血凝素（HA）和神经胺酸酶（NA）。
1、血凝素（HA）：呈柱状，被胰蛋白酶消化成二个多肽：HA1、HA2
功能：凝聚红细胞—血凝现象，鉴定病毒（定性）；吸附宿主细胞—与受体结合；具有抗原性—产生相应抗体：中和病毒，抑制血凝（定型）
HA抗原结构易发生变异
2、神经氨酸酶（NA）：呈蘑菇状，能水解红细胞表面的神经氨分子。是弱中和抗原
功能：参与病毒释放、促进病毒扩散、具有抗原性—产生非中和抗体
（二）变异
病毒核酸为分节段的负链单股RNA，甲型和乙型分8个节段，丙型分7个节段，每个节段均为独立基因组，这一特点使基因在复制中易发生重组而致病毒变异。这其中又以HA/NA的变异性为强，且两者的变异相互独立。
1、抗原漂移（antigenic drift）：因HA或NA的点突变造成，变异幅度小，属量变，引起局部中、小型流行。
2、抗原转换（antigenic shift）：因HA或NA的大幅度变异造成，属质变，导致新亚型的出现，引起世界性的暴发流行。
二、致病性与免疫性
（一）致病性
1、传染源：患者、隐性感染者。传播途径：飞沫传播
2、机理：在呼吸道柱状上皮增殖，不引起病毒血症。NA可降低细胞表面粘度，使细胞表面受体暴露，便于病毒侵袭
3、致病特点：发病率高，死亡率低。
4、并发症：多见于婴幼儿、老人、慢性病患者。原发性病毒性肺炎、继发细胞性肺炎。
（二）免疫性：病后对同型病毒有牢固免疫力
抗HA抗体：中和抗体，能阻止病毒侵入易感细胞
抗NA抗体：能限制病毒释放和扩散。
CTL：可杀伤流感病毒感染细胞，在促进受染机体的康复方面也起重要作用。
同型抗HA抗体有短暂免疫力（1-2年）三型交叉保护，对新亚型均无免疫力。
三、微生物学检查法
（一）查病毒：咽拭子，咽漱液→鸡胚羊膜腔（初次接种），35℃ 孵育3天，收集羊水和尿囊液，做红细胞凝集试验
阳性（+）：做血凝抑制试验，确定型、亚型
阴性（-）：鸡胚培养3代，做血凝试验均为（-），才能报告为无病毒
（二）查抗体
血凝抑制试验、免疫荧光试验、酶联免疫吸附试验、补体结合试验
（三）检测核酸
①从标本中提取病毒RNA，点样于尼龙膜上，干燥 后与32P标记的流感病毒特异性cDNA探针进行分子杂交，孵育6h，经放射自显影检测点样膜是否结合有探针。
②用RT-PCR技术扩增标本中流感病毒的RNA。
四、防治
（一）预防：空气流通；每100m3空间用2 ～4ml 醋酸10倍稀释加热熏蒸，消毒空气；灭活或减毒（流行株）活疫苗 → 皮下注射或鼻腔喷雾
（二）治疗：尚无特效治疗方法，金刚烷胺对甲型流感病毒复制有抑制作用，在预防和治疗上有一定效果。目前主要是对症治疗及预防继发细菌感染。
中药：金银花、板兰根、大青叶等在减轻症状缩短病程方面有一定效果。
B、禽流感病毒
禽流感病毒(AIV)是甲型流感病毒的一种亚型，可引起禽流行性感冒（简称禽流感）。近十几年，禽流感多次呈暴发性、大范围性流行,涉及多个国家和地区。原本只感染鸡的禽流感病毒亦令人类患病。目前发现最易感染人类的高致病性禽流感病毒亚型有H5N1、H9N2、H7N7、H7N2、H7N3 等，其中感染H5N1亚型的患者病情严重，致死率高。
C、甲型H1N1流感病毒
引起甲型H1N1流感，在人群中传播。该病毒毒株包含猪流感、禽流感和人流感三种流感病毒的基因片段。人群对甲型H1N1流感病毒普遍易感，并可经人传染人。
肝炎病毒
肝炎病毒：是引起病毒性肝炎的病原体，这些病毒分别属于不同病毒科，性状显著不同，但均以肝细胞为唯一复制场所，引起病毒肝炎。
甲型肝炎病毒和戊型肝炎病毒由消化道传播，引起急性肝炎，不发展成慢性肝炎或者慢性携带者；乙型肝炎病毒和丙型肝炎病毒主要是血源性传播，除引起急性肝炎外，还可致慢性肝炎，并与肝硬化和肝癌有关；丁型肝炎病毒为缺陷病毒，必须在嗜肝DNA病毒辅助下才能复制，故其传播途径与乙型肝炎病毒相同。
乙型肝炎病毒
乙型肝炎病毒属于嗜肝DNA病毒科，正嗜肝DNA病毒属。是乙型肝炎的病原体。其感染是全球性的卫生问题，我国尤其严重，携带者10%，大约1.2亿。
一、临床意义
（1）传播途径：输血及血制品、不洁注射、围产期母婴传染、性接触。
（2）传染源：患者、无症状HBsAg携带者。潜伏期：6~16周
（3）临床特点：本病常导致慢性感染，少数可发展成肝硬化或肝癌。全球约有3.5亿慢性携带者，其中20~35 %最终导致肝硬化或肝癌。
（4）临床类型：①急性肝炎：急性黄疸型 / 急性无黄疸型、②慢性肝炎、③重型肝炎、④淤疸型肝炎、⑤肝炎肝硬化
二、生物学性状
1、形态与结构
（1）外衣壳（相当于包膜）：由脂质双层与蛋白质组成
含有：乙型肝炎表面抗原（HBsAg）、多聚人血清白蛋白受体（PHSAr）即吸附位点、前S抗原（Pre-S1.2）
（2）内衣壳，20面体，
含有：乙型肝炎核心抗原（HBcAg）、乙型肝炎e抗原（HBeAg）
（3）核心：DNA及DNA聚合酶
形态：电镜下病人血清中有三种病毒颗粒
大球形颗粒：42nm，即（Dane颗粒），完整的病毒颗粒，三种抗原均有，有传染性
小球形颗粒： 22nm / 管形颗粒：22nm×（100~700）nm。这两者只有表面抗原，是复制过剩的外衣壳，不具有传染性。
2、基因结构、功能
HBV的DNA为不完全双链环状DNA（未闭合环状双链DNA）
（1）长链——负链（L-）
为模板，编码病毒蛋白，含有4个开放读码框架（ORF）
（2）短链——正链（S+）
HBV副链4个ORF
S区： S基因，PreS1. 2基因。编码HBsAg、PreS1. 2
C区：C基因，Pre-C基因。编码HBcAg、Pre-C 蛋白经切割→HBeAg
P区：编码DNA多聚酶（逆转录酶功能）
X区：编码x蛋白（HBxAg）激活原癌基因，与肝癌发生发展有关
基因分型（A-H型，共8型）
A型常见于欧洲、北美和非洲。B型和C型流行于亚洲。D型见于全世界。E型分布在非洲。F型见于南美和阿拉斯加。G型见于北美。H型存在于中美
3、抗原组成
①表面抗原（HBsAg）
三种颗粒上均有，大量存在于患者血中，是HBV感染的主要标志，分亚型（a, d/y, w/r, adr）；具有抗原性（弱），其抗体HBsAb）为中和抗体，建立免疫标志，是制备疫苗的最主要成分
Pre S1、Pre S2及抗- Pre S1和抗- Pre S2
②核心抗原（HBcAg）
存在于Dane颗粒上，血中难以检出（仅存在于肝细胞内），可存在于感染的肝细胞表面。抗原性强，其抗体HBsAb无中和作用，HBsAb-IgM提示HBV正在复制，HBsAb-IgG提示病毒持续时间长
③e抗原（HBeAg）
存在于内衣壳，为可溶性蛋白，可游离存在于血中，与Dane颗粒出现平行。其消长，与DNA聚合酶消长一致。有抗原性，抗体HBeAb无中和作用（与游离HBeAg结合，不能阻止吸附），与肝细胞表面HBeAg结合，破坏受感染细胞，建立部分免疫力，是预后良好的征象；其Pre-C突变株，不被HBeAb识别
4、动物模型与细胞培养
黑猩猩动物模型、鸭动物模型
用分子生物学技术的细胞培养成功
5、抵抗力强：抵抗力强于HAV，对低温干燥紫外线耐受，不被70％乙醇灭活，100℃ 10分钟可灭活
6、预防：急性期隔离患者。严格筛选血缘。严格消毒注射器。接触污染源后立即注射乙肝疫苗和含抗-HBs的高价免疫球蛋白(HBIG)。新生儿预防接种。
三、微生物学检查
（一）标本的采集与处理：采集病人血液标本
血清学测定：24h内分离血清或血浆，5日内作测定。
核酸分析：6h内处理，24h内检测
（二）常用方法
1、主要为血清学检测：一般检测HBsAg，辅以抗HBs、HBeAg、抗-Hbe、抗-HBc、抗HBc-IgG/M，
①HBsAg与HBsAb
HBsAg：ALT升高前2~4周出现，表明有急、慢性乙肝或为无症状携带者。
抗-HBs（HBsAb）：恢复期出现/HBsAg疫苗注射后出现，为保护性抗体，表明病毒基本清除，是乙肝痊愈的标志。也是免疫成功的标志。
②HBcAg与HBcAb
HBcAg：血清中几乎检测不到。
抗-HBc（HBcAb）：ALT开始升高时出现，高效价IgM抗体(>1:1000）是急性感染的标志。
③HBeAg与HBeAb
HBeAg：一般见于HBsAg阳性者血清中。为体内HBV复制及血清具有传染性的标志。
抗HBe（HBeAb）：阳性标本病毒体数量显著降低。
④检测方法：ELISA(最常用，定性)；免疫层析法（胶体金或硒标法）；发光免疫分析(定量)；反相间接血凝试验(少用)
ELISA：利用抗原和抗体特异性结合
间接法： 测定抗-HBs / 夹心法：测定HBsAg和HBeAg / 竞争法：测定抗-HBc和抗-HBe
2、核酸检测：检测血清中存在的HBV-DNA ，是HBV感染最直接的证据
反转录病毒
人类免疫缺陷病病毒
获得性免疫缺陷综合征，简称艾滋病（AIDS）由一种名为“人类免疫缺陷病毒”（HIV）所导致的疾病。 主要侵袭辅助Ｔ淋巴细胞，破坏免疫系统，最终使患者免疫功能衰竭而死亡。 传染性强，死亡率高，号称“超级癌症”。
HIV属于逆转录病毒科慢病毒亚科。
一、临床意义
HIV感染的主要靶细胞为CD4+T细胞，可引起CD4+T细胞的不断下降，导致感染者细胞免疫功能缺损，并继发体液免疫功能缺损，最终进入AIDS期，因各种机会性感染及肿瘤而死亡。
传染源：HIV无症状携带者和艾滋病患者。其外周血、精液、阴道分泌物、乳汁、唾液、脑脊液、骨髓等标本中均可分离到病毒。
传播途径：性接触传播、血液传播及母婴传播。我国卫生主管部门的统计表明，中国的艾滋病传播途径比例分别为：静脉注射吸毒感染占69.8%，性接触感染占6.9%，采供血感染占6%；余下的百分之十几，为母婴传播和其它特殊途径传播。
全过程分为：原发感染急性期、无症状潜伏期、AIDS相关综合征期、艾滋病期
1、原发感染急性期：此时感染者血清中出现HIV抗原；患者出现发热、咽炎、肌肉痛、关节痛、淋巴结肿大、皮肤斑丘疹和粘膜溃疡等自限性症状。
2、无症状期：感染者无明显症状；外周血中HIV抗原含量很低或检测不到；少量病毒在细胞内低水平持续复制，大部分HIV以前病毒的形式整合于宿主细胞的染色体内；持续6个月至10年。
3、艾滋病相关综合征期：当机体受到某些因素激发，HIV在细胞内大量复制并造成免疫系统进行性损害；患者出现发热、盗汗、疲倦、慢性腹泻和持续性淋巴结肿大等症状。
4、艾滋病期：为感染HIV后的最终阶段。病人CD4+ T淋巴细胞计数明显下降，多<200/μl，HIV血浆病毒载量明显升高。此期主要临床表现为HIV相关症状、各种机会性感染及肿瘤。HIV相关症状：主要表现为持续一个月以上的发热、盗汗、腹泻；体重减轻10%以上。部分病人表现为神经精神症状，如记忆力减退、精神淡漠、性格改变、头痛、癫痫及痴呆等。另外还可出现持续性全身性淋巴结肿大。
典型的AIDS有三大临床表现：
①机会感染：是AIDS患者死亡的重要原因之一；涉及细菌、病毒、真菌和寄生虫等病原体，以卡氏肺囊虫 、白色念珠菌、单纯疱疹病毒、巨细胞病毒、肝炎病毒、隐球菌、鼠弓形体等常见；
②恶性肿瘤的发生：如kaposi肉瘤和B细胞淋巴瘤等恶性肿瘤；
③神经系统异常：约有1/3的AIDS患者出现中枢神经系统疾病，如艾滋病痴呆综合征，表现为记忆衰退、偏瘫、颤抖、痴呆等神经、精神症状。
二、生物学性状
（一）形态结构：为RNA病毒，呈球形，直径100—120nm，电镜下可见一致密的棒状/截头圆锥状核心。病毒体外层为脂蛋白包膜，其中镶嵌有gp120/gp41两种特异糖蛋白。病毒内部为20面体对称的核衣壳。
1、核心：2个逆转录酶 - 将RNA转录成DNA。蛋白酶 (p11) - 将大片断蛋白切小。整和酶 (p32) - 将HIV原病毒DNA插入宿主细胞DNA中。核心膜蛋白(p24, p17)
2、包膜：脂质膜 - “借用”宿主细胞的细胞膜。gp120 - 病毒的膜蛋白，与被感染细胞CD4相结合部分。gp41 -病毒的膜蛋白，跨脂质膜的部分
（二）HIV的生活周期
增殖周期包括5个阶段：吸附、穿入、脱壳、复制与合成、装配与释放
HIV主要通过gp120与宿主细胞膜表面的相应受体结合进入细胞：HIV gp120 结合CD4 / 辅助受体
RNA酶H：仅作用于RNA-DNA中间体中的RNA
前病毒：在病毒整合酶的协助下，病毒基因组整合入细胞染色体中，这种整合的病毒双链DNA即前病毒。
HIV的核心抗原和各种酶蛋白比较恒定，变异主要是包膜糖蛋白。
HIV-1的反转录酶是HIV-1复制的一个主要酶，它具有DNA聚合酶的合成功能，但不具有DNA聚合酶的校正功能，因此在HIV-1的复制过程中，病毒核酸表现出高频的碱基错配。在这些遗传改变中，可能会引起反转录酶和蛋白酶分子的空间构型发生改变，致使病毒对作用于这两种关键酶的抗病毒药物治疗药物不再敏感。
（三）分型
HIV有两型，分别为HIV-1和HIV-2。两者的结构和致病性相似。世界范围的AIDS主要由HIV-1所致，约占95%。
（四）抵抗力
HIV对理化因素的抵抗力不强，56℃加热30分钟或用0.5%次氯酸纳/甲酚皂、0.1%漂白粉、70%乙醇、0.3%过氧化氢、1%戊二醛等消毒剂处理10分钟均能灭活病毒。室温（20℃-22℃）可存活7天。
（五）培养特性
HIV仅感染表面有CD4受体的细胞。实验室中常用正常人T细胞分离病毒。感染病毒的细胞出现CPE。动物模型可用HIV感染恒河猴和黑猩猩。
三、致病性与免疫性
1、HIV感染和致病的主要特点是能选择性地侵犯表达CD4分子的细胞，引起以CD4+T细胞缺陷和功能障碍为中心的严重免疫缺陷 。
CD4+ 细胞主要是Th细胞，也包括单核-巨噬细胞、树突状细胞、神经胶质细胞、皮肤的朗格汉斯细胞及肠道粘膜的杯状、柱状上皮细胞等少量表达CD4分子的细胞。
2、HIV的致病机制
①CD4+细胞受损：病毒在细胞内增殖干扰细胞的正常代谢 / 子代病毒出芽释放，导致细胞被破坏 / 融合形成多核巨细胞，其寿命明显缩短、HIV诱导细胞凋亡 / 特异性细胞毒效应导致细胞被破坏
②HIV干扰T细胞的抗原识别：CD4与MHC-Ⅱ类分子的相互作用是T细胞识别抗原肽所必需的，HIVgp120与CD4分子的结合干扰了T细胞对抗原的识别，使T细胞不能对HIV发生有效的免疫应答。
③HIV诱导的自身免疫应答：HIV gp120和MHC-Ⅱ类分子均能与CD4分子的相同区域结合，提示这两种分子可能存在共同决定簇，因此针对HIVgp120的特异性抗体能与MHC-Ⅱ类分子发生交叉反应，破坏免疫活性细胞。
④HIV超抗原成分的致病作用：HIV基因编码产物有超抗原样作用，其致病机制为：作为T细胞的强活化剂，过度激活T细胞， 最终导致T细胞无能反应或细胞死亡；激活多克隆B细胞，造成B细胞功能紊乱。
⑤HIV的播散：HIV在单核/巨噬细胞内低度增殖，并将病毒播散至其它组织；
⑥HIV的其它病理作用：HIV感染单核/巨噬细胞，可损伤其趋化、粘附、杀伤和抗原提呈能力；HIV可诱导巨噬细胞分泌大量IL-1和TNF-α，导致患者长期低热，并引起恶病质；受染的树突细胞抗原提呈功能下降并可将病毒传播给CD4+T细胞。
3、HIV的致病结果
HIV引起以CD4+细胞缺陷和功能障碍为中心的严重免疫缺陷。
（1）细胞免疫功能低下
健康人外周血中CD4+T细胞数量为1000个/ml，晚期AIDS患者则在100个/ml以下。当CD4+细胞下降到每毫升200个以下时，病毒的滴度迅速升高，机体的免疫应答出现崩溃。
迟发型变态反应减弱或消失；
T细胞对有丝分裂原、特异性抗原、同种异体抗原的增殖反应低下；
由T细胞或NK细胞引起的细胞毒性反应降低
（2）体液免疫功能紊乱
在疾病早期由于B细胞的多克隆性激活可出现高免疫球蛋白血症、多种自身抗体产生、CIC形成。
随着病情的发展，抗体的产生能力下降。
（3）侵犯多种组织器官
通过感染单核-巨噬细胞、树突状细胞、神经胶质细胞、皮肤的朗格汉斯细胞及肠道粘膜的杯状、柱状上皮细胞等少量表达CD4分子的细胞，HIV被播散到全身，引起中枢神经系统、肺、肠及其它器官感染致病。
4、免疫性：感染过程中机体可以产生多种抗体和细胞免疫，但不足以清除病毒。
四、微生物学检查
（一）直接检测病毒或其组成部分
1、P24抗原测定：
适用范围：HIV-1抗体不确定或窗口期的辅助诊断；HIV-1阳性母亲所生婴儿的鉴别诊断；第四代HIV-1抗原/抗体ELISA试剂检测呈阳性反应， 但HIV-1抗体确认阴性者的诊断；监测病程进展和抗病毒治疗效果。
结果报告和解释：HIV-1 P24抗原的阳性结果必须经过中和试验确认；HIV-1 P24抗原阳性仅作为HIV感染的辅助诊断依据，不能依此确诊；HIV-1 P24抗原阴性结果不能排除HIV感染
2、HIV核酸检测
用途：窗口期辅助诊断；病程监控；指导治疗方案及疗效评价；预测疾病进程
样品采集与处理：用于HIV核酸检测的样品有全血、血浆、组织和其他分泌物，有时还包括生物制品
采集样品应避免微生物和核酸污染。避免RNA酶造成的降解，采样后4-8小时内处理。处理后的样品应分装、标记，冻存于-20℃以下，RNA类样品冻存于 -80℃
应在2-8℃条件下运送。特殊情况下，可以用特快专递形式投寄，但必须将盛样品的试管包扎好，保证不会破碎和溢漏。
①定性检测：
用于HIV感染的辅助诊断。通常使用PCR或RT-PCR技术，通常根据扩增产物的电泳图像判定结果，阳性结果还要进行核酸序列测定来确定。
HIV核酸检测阴性, 只可报告本次实验结果阴性，不可排除HIV感染。HIV核酸检测阳性, 可作为诊断HIV感染的辅助指标，不单独用于HIV感染的诊断。
②定量检测
常用于监测HIV感染者的病程进展和抗病毒治疗效果。目前常用的方法有逆转录PCR实验（RT-PCR）、核酸序列扩增实验（NASBA）、分支DNA杂交实验（bDNA）等，这几种进口试剂盒的最低检测限为20-50拷贝/毫升
测定结果小于最低检测限时，应注明最低检测限水平。注意低于最低检测限的结果不能排除HIV感染。
3、病毒的分离培养
可用于HIV-1感染的辅助诊断及HIV-1抗体阳性母亲所生婴儿早期的辅助鉴别诊断
培养及分离HIV需要在特定的P3实验室进行，且HIV的分离率在30%-60%，这项试验仅用于HIV株的保存和科学研究
（二）检测人体HIV免疫反应——HIV特异性抗体
目前临床上实际应用的是测定特异性HIV抗体，包括初筛和确认实验。但从感染到血清抗体阳转有一段窗口期，平均为1-3个月，有一小部分HIV感染者出现延迟反应，需引起注意
目前常用的筛查试剂有酶联免疫(ELISA)、颗粒凝集和其他快速诊断试剂。采供血机构进行血液筛查应采用酶联免疫试剂。
1、ELISA：目前最常用的初筛实验
1985年第一代检测HIV-1抗体的试剂盒问市（全病毒抗原间接法）
目前采用第四代检测HIV-1抗体的试剂盒（以重组的多肽抗原和抗P24抗体包被的双抗原夹心法），窗口期缩短了2-3周。
结果报告处理：阴性反应出具HIV抗体阴性报告。如果近期有高危行为，如性乱、注射毒品等，或有急性流感样症状等情况，为排除“窗口期”的可能，可以进行HIV-1 P24抗原或HIV核酸检测，或2－3个月以后再做抗体检测。筛查实验呈阳性发现反应，可出具“HIV抗体待复查”的报告，不能出阳性报告。
2、快速诊断试剂：采用乳胶凝集、免疫斑点和免疫层析三种原理，快速、不需特殊仪器，但敏感度、特异度低于ELISA，且价格贵。适用于血站覆盖不到的边远地区/城市大医院急诊手术前检查。快速诊断阳性结果还需经ELISA方法验证。
3、确认试验：常用的确认实验方法是免疫印迹法（WB）
免疫印迹试剂有HIV-1/2混合型和单一型，一般先用HIV-1/2混合型试剂进行检测。用聚丙烯酰胺凝胶电泳将纯化的HIV抗原蛋白分开后转移到硝酸纤维膜上，标本的HIV抗体与条带上的抗原结合，再加入酶偶联的抗人IgG抗体和底物，在抗原抗体结合的部位会出现有色条带，可检测标本中针对HIV不同抗原的抗体，故被用做确认试验。不过不同的研究机构有不同的判定标准
4、CD4+T淋巴细胞计数
HIV感染通过多种直接和间接的病理机制，导致CD4+T数量的缺失。CD4+T淋巴细胞是HIV感染最主要的靶细胞，其数量和功能的下降是HIV感染引起人体免疫功能缺陷的主要体现。外周血中CD4+T淋巴细胞的数量对于确定HIV感染状态、是否进入AIDS期、机会性感染及肿瘤发病的可能性以及评价治疗效果具有极其重要的作用。 目前的标准方法为流式细胞仪检测。
真菌
一、 定义
真菌(fungus)是一类具有典型细胞核，有核膜和核仁，胞浆内有完整的细胞器，无根、茎、叶，不含叶绿素，无光合色素，细胞壁含几丁质和纤维素的，单细胞或多细胞异养真核细胞型微生物。
细胞壁：不含肽聚糖，含几丁质及纤维素
二、分类
临床分类 (按致病部位)：浅部真菌、 深部真菌
形态学分类：单细胞真菌、 多细胞真菌
真菌的形态与结构在鉴定上起重要作用
三、生物学形状
（一）形态与结构
1、单细胞真菌：圆形或卵圆形，包括酵母型和类酵母型真菌。
酵母型真菌以芽生方式繁殖，芽生孢子成熟后脱落成独立个体，不产生菌丝，其菌落与细菌菌落相似。
类酵母型真菌也以芽生方式繁殖，菌落与酵母型真菌相似，但它产生的芽体不从母细胞上脱落，而是延伸入培养基内形成假菌丝。
对人致病的主要有新生隐球菌和白假丝酵母菌。
2、多细胞真菌：由菌丝和孢子两种基本结构组成
（1）菌丝：在环境适宜情况下由孢子萌发长出芽管，逐渐延长呈丝状，称菌丝。
按照功能分为：
①营养菌丝：伸入培养基；
②气生菌丝：露出培养基向空气中生长；
③生殖菌丝
按照结构分为：
①有隔菌丝：多数致病性真菌；②无隔菌丝。
菌丝的形态大小不一 (螺旋状/球拍状/鹿角状)、菌丝间有无分隔、形状特征 (绒毛状/絮状/粉末状) → 鉴别真菌
（2）孢子：由生殖菌丝产生的一种繁殖体，是真菌的繁殖结构。 有有性孢子和无性孢子两类
①有性孢子：同一菌体或不同菌体上的2个细胞融合经减数分裂形成。 包括：卵孢子、接合孢子、子囊孢子、担子孢子，多为非致病性真菌所产生。
②无性孢子：菌丝上的细胞分化或出芽生成，不经两性细胞的配合。病原性真菌大多形成无性孢子。
可分为三种
a. 分生孢子：又可分为大分生孢子（其大小、细胞数和颜色是鉴定的重要依据）、小分生孢子（真菌都能产生，诊断意义不大）
b. 孢子囊孢子
c. 叶状孢子：又可分为芽生孢子（一般芽生孢子生长到一定大小仍不与母体脱离，则形成假菌丝）、厚膜孢子（是真菌的一种休眠形态）、 关节孢子
真菌种类不同，孢子形状大小也不同 → 鉴别真菌
3、二相性真菌：少数真菌在营养、温度、理化因素等不同环境条件下，可发生单细胞与多细胞两种形态的可逆转化，称为双向性真菌。
（二）培养特性
1、培养条件
营养：一般细菌用培养基上都能生长，常用沙保(Sabouraud)培养基
温度：22 ℃ ~28℃ (深部真菌：28 ℃ / 37℃)
pH：4.0~6.0 (弱酸性)
需氧、 湿度高
2、生长速度：
浅部真菌生长慢 (1~4周见典型菌落)，深部真菌生长快（3~4天见典型菌落）
3、菌落特征：
酵母/酵母样菌（光滑、柔软、湿润）、丝状菌（疏松 ，绒毛状/棉絮状/粉末状）。颜色 (正 / 背面)
（三）临床意义
若在人体正常无菌部位分离到非病原性真菌，且37℃生长，加上临床表现，可视为该病人的病原体
1、全身性真菌病：
病原性真菌：组织胞浆菌、 芽生菌（急慢性 /局部肉芽肿性炎症）、隐球菌
条件致病菌：念珠菌、曲霉菌、毛霉菌
2、浅部真菌病：皮肤真菌、瓶形酵母、白色念珠菌
3、皮下真菌病：较少见
4、其他：真菌过敏、真菌中毒、真菌毒素致癌
四、真菌微生物学检验常用技术
1. 标本采集：
皮肤/指甲（屑）、毛发、血液、脑脊液、胸腹水、脓液、口咽、 泌尿生殖道（注意正常菌群的污染）
2. 直接检查：
染色标本 (乳酸酚棉兰染色) 、不染色标本（观察菌丝 /孢子形态）、其它染色（墨汁负染：观察新型隐球菌及其荚膜）、10%KOH （观察癣菌，菌丝/孢子)
抗原检出：隐球菌荚膜多糖抗原、白色念珠菌甘露聚糖抗原
3. 分离培养：
培养基：Sabourad培养基（非选择培养基）、选择培养基、鉴别培养基
培养方法：试管法（用途：初代培养、菌种保存）、大培养（斜面，用途：纯种的培养、研究）、小培养（玻片，用途：菌种鉴定）、其他(玻片法、钢圈法、方块法)
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