胃癌通常起源于胃黏膜上皮细胞［1］，是我国较为常见的消化道恶性肿瘤之一。根据我国的流行病学调查研究，胃癌的死亡率居于总体肿瘤的第3位，发病率居于总体肿瘤的第2位［2］。由于其起病隐匿，早期通常无明显症状，明确诊断时多数患者已处于中晚期，无法及时通过手术进行治疗［3］。而以药物为主的治疗方法又因胃癌病因的复杂性，导致药物的利用率过低［4］。因此，发现胃癌治疗的新靶点并开发相关药物迫在眉睫。近年来的研究表明，中药或天然药物可以通过调节免疫系统、调节细胞凋亡等功能发挥抗癌作用［5］。且大量临床研究证明，活血化瘀类中药或中药复方治疗胃癌有显著作用［6］。因此，从传统中药或天然药物中寻找具有抗胃癌作用的药物并探索其作用机制在临床及新药开发方面均具有重要意义。
黄瑞香Daphne giraldii Nitsche为瑞香科瑞香属植物，其根皮和茎皮可入药，为祖师麻的基原植物之一。其性温，味辛、苦，入心、肝经，具有活血通络、散瘀止痛之功效，民间常用于治疗胃痛、风湿疼痛、跌打损伤等症［7］。从黄瑞香中分离并鉴定的主要有香豆素类、黄酮类、木脂素类、二萜类、三萜类等化合物［8］。现代药理学研究表明，黄瑞香化学成分具有显著的抗肿瘤活性，包括对胃癌细胞的抑制作用［9］。
网络药理学是基于系统生物学，使用一系列生物网络，以药物的活性化合物、潜在靶点、所治疗疾病之间相互作用的系统性和整体性为出发点，预测药物治疗疾病的药理学机制的一种方法，其与中医治病的“整体观”理论及中药多成分-多靶点-多作用的特点具有一致性［10-11］。因此，本研究以网络药理学为基础，对祖师麻基原植物黄瑞香的潜在靶点及通路进行预测和研究，同时结合细胞实验进行初步验证，为其治疗胃癌提供理论基础与科学依据。
通过TCMSP数据库以及课题组前期的研究，筛选得到黄瑞香的70个活性成分。通过Swiss Target Prediction数据库和PharmMapper数据库预测筛选其潜在靶点，根据阈值进行筛选，共得到929个靶点。
为进一步了解化合物与其靶点之间的关系，使用Cytoscape软件建立化合物-靶点网络图（图1）。在化合物-靶点网络中，共包含944个节点和7 169条边，体现了黄瑞香多成分、多靶点的特点（表2）。
通过GeneCards数据库和DisGeNET数据库搜索分别得到胃癌相关靶点3 485个和301个。使用jvenn网站对成分相关靶点及疾病靶点进行分析，绘制韦恩图（图2），共得到42个交集靶点。
将42个交集靶点上传至STRING数据库进行分析，得到PPI网络。该网络包括32个节点以及128条边。这些靶点之间紧密连接，形成一个复杂的网络。利用Cytoscape软件构建网络图，如图3所示。结果发现，表皮生长因子受体（EGFR，degree＝23）、丝裂原活化蛋白激酶1（MAPK1，degree＝21）、丝裂原活化蛋白激酶3（MAPK3，degree＝20）、肿瘤坏死因子（TNF，degree＝18）、丝裂原激活蛋白激酶8（MAPK8，degree＝15）、人环加氧酶2（PTGS2，degree＝15）、酪氨酸激酶受体2（ERBB2，degree＝13）、磷脂酰肌醇（PIK3CA，degree＝12）等基因具有较高的度值，表明这些基因靶点可能在黄瑞香抗胃癌中发挥重要作用。
将交集靶点导入到Metascap数据库进行GO以及KEGG富集分析，并将其分析数据结果按照P值进行排序，并用Image GP作图。结果表明，这些潜在靶点的功能与多种BP、CC、MF有关。
在GO-BP方面（图4），共富集到650个BP。用气泡图富集最为显著的前20个BP，其主要包括脂多糖反应、细胞应激反应、蛋白质磷酸化的正调控、细胞对化学应激的反应、细胞对有机氮化合物的反应以及氧化应激等过程。表明黄瑞香的活性化合物可能通过调节多种生物途径发挥治疗胃癌的作用。
在GO-CC方面，共富集到35个与CC相关的条目。按P＜0.01选取前20个条目进行分析。如图5所示，靶点主要富集在膜筏、膜微区、受体复合体、核被膜以及核膜等CC中。
在GO-MF方面，共富集到与MF相关的37个条目。按P＜0.01选取前20个条目进行分析。图6的气泡图表明，交集靶点主要富集在蛋白激酶活性、磷酸转移酶活性、氧化还原酶活性、激酶结合、跨膜受体蛋白酪氨酸激酶活性等MF中。
利用Metascape对交集靶点进行KEGG富集分析，并利用微生信在线作图软件根据P值和富集的靶点数量构建排名靠前的20条通路的柱状图，如图7所示，主要包括癌症、胃癌、磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B（PI3K/Akt）以及丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）等信号通路。利用Cytoscape软件构建化合物-靶点-通路网络图（图8）。
通过该网络图，表皮生长因子受体（EGFR）、丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶（BRAF）、MAPK3、磷脂酰肌醇（PIK3CA）、甲硫氨酸（MET）等蓝色节点以及daphnegiralin B2（MOL 36，degree＝10）、daphnegiralin A1（MOL 31，degree＝10）、daphnegiralin A4（MOL 34，degree＝9）和daohnegiravan E（MOL 55，degree＝8）等绿色节点（大部分为异戊烯基黄酮成分）可能为黄瑞香发挥抗胃癌作用的主要靶蛋白和成分。以上结果表明，黄瑞香中的同1个活性成分可能作用于多个靶点或通路，且同1个靶点也可能被多个活性成分影响，层层链接，形成多组分-多靶点-多途径的调控网络，从而发挥治疗胃癌的作用。
为进一步探讨黄瑞香发挥抗胃癌作用的主要成分，首先从课题组现有的前期从黄瑞香中分离得到的部分化合物构树黄酮醇F、daphnegiravone D、daphgiflavone C、broussoflavonol B、macarindicin E、daphnegiranol D、（2S）-kazinol B、isolicoflavonol、broussonol D进行活性筛选［12］。结果发现，在筛选的化合物中，构树黄酮醇F（MOL 37）、daphnegiravone D（MOL 35）、daphgiflavone C（MOL 9）具有较强的体外抑制胃癌细胞MGC803生长作用，且3种成分对胃癌MGC803细胞的生长抑制作用呈浓度相关性（图9）。
其作用于胃癌MGC803细胞48 h的半数抑制浓度（IC50）分别为（12.19±2.31）、（10.41±1.78）、（9.02±1.49） μmol·L-1。而这3种化合物也在所构建的化学成分-靶点网络图中的排名较靠前，其度值分别为150、149、140。此外，在化学成分-靶点-通路网络图中，这3种化合物的度值同样比较高，分别为7、6、6。以上活性筛选结果，也说明了网络药理学预测的科学性，即活性较好的成分在网络的构建中具有较高的排名。
为初步考察黄瑞香活性成分抑制胃癌细胞的分子机制，采用qRT-PCR法检测网络药理学预测的可能其主要作用的基因EGFR、PI3K、Akt表达情况，由图10可知，与对照组比较，化合物构树黄酮醇、daphnegiravone D、daphgiflavone C（10 μmol·L-1）均可显著抑制上述基因的表达（P＜0.05、0.01、0.001），验证了网络药理学预测结果。
本研究基于网络药理学方法［18］对黄瑞香抗胃癌作用的潜在靶点及通路进行预测。化合物-靶点网络以及化合物-靶点-信号通路网络中，度值最高的成分大部分为异戊烯基黄酮类化合物。有研究表明，异戊烯基黄酮类化合物黄腐酚能够诱导胃癌细胞发生凋亡以及活性氧的累积从而抑制胃癌细胞AGS的增殖［19］。此外，Toume等［20］研究也表明，从面包树提取得到的异戊烯基黄酮类化合物artonin E能够通过诱导活性氧的产生和p53介导的DR5表达上调诱导胃腺癌细胞外源性凋亡。
本研究网络药理学预测研究中，通过对化合物-靶点-信号通路网络图以及PPI网络图分析，发现EGFR、PIK3CA等可能是黄瑞香活性成分主要的潜在作用靶点。EGFR是一种多功能受体跨膜糖蛋白，是生长因子受体酪氨酸激酶家族的成员，对于肿瘤细胞的增殖、迁移起到促进作用［21］。在胃癌组织中，EGFR处于阳性表达且与预后恶化显著相关［22］。而基于EGFR的靶向治疗可通过阻断EGFR驱动的抗凋亡途径达到肿瘤特异性治疗效果［23］。研究表明，萘酰亚胺衍生物NA20可通过抑制EGFR引起细胞发生周期阻滞和细胞凋亡，从而抑制胃癌细胞的增殖［24］。从贝母中提取的天然活性成分贝母乙素可通过调节EGFR的表达从而提高胃癌细胞对化疗药物阿霉素的敏感性［25］。同时黄瑞香中的西瑞香素也能够抑制人EGFR酪氨酸特异性蛋白激酶活性［9］。
PIK3CA是PI3K家族成员。PIK3CA的突变能够催化PI3K，进而持续激活PI3K/Akt信号通路，从而参与多种肿瘤的发生发展过程［26］。而KEGG通路富集结果也表明黄瑞香发挥抗胃癌作用可能与PI3K/Akt信号通路有密切关系。已有研究表明，红树莓提取物能够通过阻碍PI3K/Akt信号通路抑制胃癌细胞AGS的增殖、迁移和侵袭［27］。黄瑞香中的瑞香素同样可以通过下调Akt通路以及ERK1/2通路显著抑制肿瘤坏死因子-α（TNF-α）和VEGF诱导的血管生成［28］。
本研究体外细胞实验结果也证实了黄瑞香中的3种异戊烯基黄酮类化合物能够抑制EGFR、PI3K以及Akt基因的表达。此外，有实验表明，微小RNA-4295能够靶向LRIG1促进EGFR/PI3K/Akt信号通路的激活，从而促进胃癌细胞增殖。而Du等［29］的研究表明3-甲基腺嘌呤可通过协同抑制PI3K/Akt/FOXO3a信号通路和EGFR表达促进埃索美拉唑的抗胃癌增殖活性。因此，推测黄瑞香可能通过调控EGFR的表达，影响PI3K/Akt信号通路，从而发挥治疗胃癌的作用。
结合本研究化合物-靶点-信号通路网络图以及KEGG通路分析结果，还发现丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶（BRAF）、甲硫氨酸（MET）具有较高的度值，且MAPK信号通路也与黄瑞香发挥抗胃癌作用有一定关系。研究表明［30］，黄酮苷类化合物木犀草苷能够促进MET的泛素化和降解以及其蛋白水平从而发挥抑制胃癌细胞生长、迁移和侵袭作用。MAPK信号通路由细胞外调节蛋白激酶ERK、p38 MAPK和 c-Jun氨基末端激酶JNK组成［31］。研究表明，BRAF作为丝裂原活化激酶MAPK通路的一部分，可增强胃癌细胞的增殖及侵袭能力［32］。
从黄瑞香中提取分离得到的异戊烯基黄酮daphnegiravone D可通过调节MAPK信号通路抑制肝癌细胞的增殖［33］。曹少祥等［34］研究表明顺铂与尼美舒利能够阻断p38 MAPK信号通路，进而抑制人胃癌细胞SGC7901增殖。此外，研究表明阿法替尼能够抑制EGFR和下游PI3K/Akt/mTOR以及MAPK信号通路发挥抗胃癌的作用［35］。因此，推测黄瑞香中的化学成分可能以EGFR为主要靶点，影响下游PI3K/Akt、MAPK等信号通路发挥治疗胃癌的作用。后续可通过动物实验进一步验证黄瑞香抗肿瘤机制及其安全性。
本研究基于网络药理学预测以及初步的细胞实验验证，发现黄瑞香可能以异戊烯基黄酮为主要的抗胃癌活性成分，以EGFR、BRAF、PIKC3A、MET等蛋白为核心作用靶点，主要经PI3K/Akt以及MAPK等相关信号通路发挥治疗胃癌的作用。这不仅初步证明了网络药理学分析的合理性和科学性，也为进一步深入研究黄瑞香抗胃癌的作用机制提供了思路和方向。
利益冲突 所有作者均声明不存在利益冲突
参考文献（略）
来 源：姜金玲，候骄洋，姚国栋．基于网络药理学的黄瑞香抗胃癌作用机制探讨及实验验证 [J]. 药物评价研究, 2023, 46(1): 24-36 .
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